Thermo Fisher Scientific PrioCHECK CSFV Ag Strip Kit Bedienungsanleitung

Marke
Thermo Fisher Scientific
Modell
PrioCHECK CSFV Ag Strip Kit
Typ
Bedienungsanleitung
Für tierärztlichen Gebrauch. Ausschließlich für in vitro zu verwenden.
GEBRAUCHSINFORMATION
PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit
ELISA für
in vitro
Nachweis von Antigenen gegen das Virus des klassischen Schweinefiebers in Vollblut, Serum, Plasma und
Gewebeproben von Schweinen
Katalog-Nummer 7610050
Pub. Nr. MAN0013843 Version A.0
Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach § 17c TierSG zugelassen
ACHTUNG! Bitte die Sicherheitsdatenblätter (SDB) lesen und Handlungsanweisungen befolgen. Es ist angemessene persönliche Schutzausrüstung (PSA) zu
tragen (Brille, Kleidung, Handschuhe). Die Sicherheitsdatenblätter (SDB) sind abzurufen unter thermofisher.com/support.
ACHTUNG! POTENZIELLE BIOGEFAHR.
Informieren Sie sich auf der jeweiligen Produktwebsite (unter thermofisher.com) über biologische Gefahren, die
von dem Produkt ausgehen können. Tragen Sie eine geeignete Schutzbrille sowie Schutzkleidung und -handschuhe.
Einführung
Die frühe Erkennung von CSFV infizierten Schweinen ist von grosser Wichtigkeit um die Verbreitung von CSFV zu verhindern. Da Antikörper aber erst etwa 14 Tage
nach eine Infizierung gebildet werden, muss in der frühen Phase der Krankheit ein Nachweis über das Anitgen erfolgen.
Applied Biosystems™ PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit weist genau diese Antigene nach und ist deshalb ideal um CSF in einem frühen Stadium zu detktieren. Der
PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit ist ausgelegt auf die Reduzierung falsch positiver Testergebnisse (hohe Spezifität) bei höchst möglicher Sensitivität. Der
PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit kann verwendet werden um Schweineherden zu untersuchen bei denen Verdacht auf eine CSFV Infektion besteht. In Ländern
(Gebieten), in denen CSF verbreitet ist und häufig geimpft wird, kann der Test verwendet werden um verbleibende CSFV-Herde aufzuspüren.
Positive Testergebnisse müssen durch einen „Gold“ Standardtest bestätigt werden (z.B. Isolierung des Virus in einer Zellkultur).
Testprinzip
Der PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit basiert auf dem Doppel-Antikörper-Sandwich (DAS) Prinzip. CSFV spezifische Antikörper sind auf Streifen-Platten beschichtet.
In einem ersten Schritt wird die Probe (Vollblut, Serum, Plasma, Leukozytenkonzentrat oder Gewebeextrakt) in Probenverdünnungspuffer verdünnt und in der Platte
inkubiert. Danach wird die Platte gewaschen und mit einem hochspezifischen anti-CSFV Konjugat inkubiert. Anschliessend wird die Platte erneut gewaschen und
das Konjugat wird über das Chromogen (TMB) Substrat nachgewiesen. Nach Zugabe einer Stopplösung ist die Farbreaktion beendet. Die bei einer Wellenlänge von
450 nm gemessene Farbentwicklung weisst auf das Vorhandensein von Antigenen, welche für klassisches Schweinefieber typischen sind, hin.
Komponenten des Testkits
Packung mit 5 Platten für 450 Proben. Das Kit soll bis zum Verfallsdatum bei
5±3°C aufbewahrt werden.Siehe Kit-Etikette für jeweiliges Verfallsdatum. Die
Haltbarkeit verdünnter, geöffneter oder rekonstituierter Komponenten ist wo
nötig nachstehend vermerkt.
Komponente
Komponente 1: Testplatte
Komponente 2:
Konjugat (30x)
chen enthält 2,2 ml Konjugat. Erst kurz vor Gebrauch
Komponente 3: Konjugat
Verdünnungspuffer
Komponente 4:
Konjugat Additiv
Komponente 5:
Demineralisiertes Wasser
Komponente 6:
Waschpuffer (200x)
Fläschchen enthält 60 ml Waschpuffer. Haltbarkeit der
Komponente 7: Proben
Verdünnungspuffer
Komponente 8:
Referenzserum 1
rum 1 (starke Positivkontrolle). Das Referenzserum 1 muss
vor gebrauch rekonstituiert werden. Das rekonstiuierte
Komponente 9:
Referenzserum 2
rum 2 (Blindprobe). Das Referenzserum 2 muss vor
gebrauch rekonstituiert werden. Das rekonstiuierte
Komponente 10:
Referenzserum 3
rum 3 (schwache Positivkontrolle). Das Referenzserum 3
muss vor gebrauch rekonstituiert werden. Das rekons-
Komponente 11:
Chromogen (TMB) Substrat
Komponente 12:
Stopplösung
Weitere Kitbestandteile
Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte
Schritt
Beschreibung(1)
Allgemein
Laborausrüstung gemäss den nationalen Sicherheitsvorschriften.
Auswertung
Platten Fotometer. Das Fotometer muss mit einem geeigneten
Filtersatz ausgerüstet sein um die Absorption bei 450 nm messen zu
können.
Optional
Plattenwascher.
(1) Sofern nichts Gegenteiliges angegeben wurde, können alle Materialien auf
thermofisher.com bezogen werden.
Ablauf des Tests
Vorsichtsmassnahmen
• Nationale Sicherheitsvorschriften müssen befolgt werden.
• Der PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit muss in Laboratorien durchgeführt
werden, die für diesen Zweck geeigneten sind.
• Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet werden und alle mit den
Proben in Berührung kommenden Gegenstände als potentiell kontaminiert
erachtet werden. Zur Dekontamination kann Halamid (1%), Natriumhy-
droxid (0,4%) oder Glutaraldehyd (1%) verwendet werden (CSFV Reduktion
von 4–5 Log in 6 Minuten). Testproben müssen steril gehalten werden um
nachträgliche Bestätigung durch einen Virusisolationstest zu ermöglichen.
Hinweise
Um optimale Ergebnisse mit dem PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit zu erhalten,
müssen folgende Aspekte beachtet werden:
• Das Testverfahren muss streng eingehalten werden
• Alle Reagentien des Kits müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur
(22±3°C) gebracht werden.
• Pipettenspitzen müssen nach jedem Pipettierschritt gewechselt werden.
• Für jedes Reagenz müssen eigene Behälter verwendet werden.
• Kitbestandteile dürfen nach ihrem Verfallsdatum oder bei einer Änderung
in ihrem Aussehen nicht mehr verwendet werden.
• Komponenten von verschiedenen Kit-Chargennummern dürfen nicht
gemischt werden.
• Demineralisiertes Wasser oder Wasser gleicher Qualität verwenden.
Vorbereitung der Lösungen
Referenzen
Die Referenzseren (Komponente 8–10) mit 1.5 ml demineralisiertem Wasser
(Komponente 5) rekonstituieren. Die rekonstituierten Seren müssen aufgeteilt
werden (12 × für maximal 12 Testläufe). Vermeiden Sie häufiges Einfrieren und
Auftauen. Die Haltbarkeit des rekonstituierte Seren bei −20°C entspricht der der
lyophilisierten Seren.
Das Rekonstituieren des lyophilisierten Antigens:
1. Fläschchen auf 22±3°C bringen.
2. Fläschchen aufrecht halten und leicht gegen die Arbeitsfläche schlagen um
sicherzustellen, dass sich der Inhalt auf dem Boden des Fläschchens befindet.
3. Fläschchen öffnen.
4. Angegebene Menge an demineralisiertem Wassers (Komponente 5) zufügen.
5. Stöpsel wieder auf das Fläschchen setzen und das Fläschchen vorsichtig
drehen, damit sich das restliche Lyophilisat auflöst.
6. Lyophilisiertes Material 15 Minuten bei 22±3°C lassen.
7. Gelegentlich Fläschchen sanft umdrehen (Schaumbildung muss vermieden
werden).
Konjugatverdünnung
Konjugat (30x) (Komponente 2) 1:30 in Konjugat Verdünngspuffer (Kompo-
nente 3), der mit 20% Konjugat Additiv versetzt ist, verdünnen; für z.B eine
platte wird eine Menge von 12 ml benötigt. Hierzu werden 400 µl Konjugat (30x)
in 9,2 ml Konjugat Verdünnungspuffer und 2,4 ml Konjugat Additiv verdünnt.
Hinweis: Die Konjugatverdünnung darf erst kurz vor ihrer Verwendung
hergestellt werden.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
11 März 2019
Waschlösung
Der Waschpuffer (200x) (Komponente 4) muss mit demineralisiertem Wasser 1:200
verdünnt werden. Eine Flache reicht für ein Endvolumen von 12 Liter.
Stabilität der Waschlösung: 1 Woche bei 22±3°C.
Zu Beachten: Das Waschen der Platte nach Inkubationen ist kritisch muss sorgfäl-
tig durchgeführt werden. Ein Messwert des Referenzserums 2 von >0,300 OD ist
höchstwahrscheinlich auf mangelhaftes Waschen der Platte zurückzuführen. Beim
manuellen Waschen der Platte sind mindestens 6 Waschzyklen nötig. Ein Wasch-
zyklus besteht aus: Befüllen jeder Vertiefung mit 300 µl Waschlösung, die Platte
sorgfältig entleeren und wieder befüllen. Bildung von Luftblasen beim Befüllen der
Vertiefungen vermeiden. Achten Sie darauf, dass nach dem letzten Waschen die
restliche Waschlösung durch Ausklopfen der Testplatte auf einer saugfähiger
Unterlage entfernt wird. Wenn OD-Blindwerte von >0,300 bei Verwendung von
automatischen Plattenwaschern erhalten werden, dann sollte die Platte manuell
gewaschen werden, wie vorstehend beschrieben.
Informationen zur Probenvorbereitung und Probenlagerung liegen in
Anhang B vor.
Inkubation von Serum und Probe
1. Jede Testplatte (Komponente 1) mit einem Markierstift beschriften.
2. 50 µl Proben Verdünnungspuffer (Komponente 7) in alle Vertiefungen geben.
3. 50 µl des rekonstituierten Referenzserums 1 in die Vertiefungen A1 und B1
zugeben.
4. 50 µl von reconstituted Referenzserums 2 in die Vertiefungen C1 und D1 geben.
5. 50 µl von reconstituted Referenzserums 3 in die Vertiefungen E1 und F1 geben.
6. 50 µl der Probe in die übrigen Vertiefungen geben.
7. Testplatte mit Abdeckfolie schliessen und sanft schütteln.
8. 180±5 Minuten bei 22±3°C inkubieren.
Hinweis: Beim Dosieren von Vollblutproben darauf achten, dass keine
Probenreste in der Pipettenspitze zurückbleiben.
Inkubation mit Konjugat
1. Die Testplatte 6 mal mit 300 µl Waschlösung pro Vertiefung waschen. Die
Platte nach dem letzten Waschzyklus fest ausklopfen.
Hinweis: Es dürfen keine Blutreste mehr in den Vertiefungen sein.
2. 100 µl der Konjugatverdünnung in alle Vertiefungen geben.
3. Testsplatte mit Abdeckfolie schliessen.
4. 60±5 Minuten bei 22±3°C inkubieren.
Inkubation mit Chromogen (TMB) Substrat
1. Die Testplatte 6-mal mit 300 µl Waschlösung pro Vertiefung waschen. Die
Platte nach dem letzten Waschzyklus fest ausklopfen.
2. 100 µl Chromogen (TMB) Substrat (Komponente 11) in alle Vertiefungen geben.
3. 15 Minuten bei 22±3°C inkubieren. Nicht Schütteln.
4. 100 µl Stopplösung (Komponente 12) zugeben.
5. Die Platte leicht schütteln.
Hinweis: Beginnen Sie mit der Zugabe der Stopplösung 15–20 Minuten nach dem
Befüllen der ersten Vertiefungen mit Chromogen (TMB) Substrat.
Geben Sie die Stopplösung in derselben Reihenfolge und Geschwindigkeit zu
wie das Chromogen (TMB) Substrat.
Messen der testplatte und Berechnung der Ergebnisse
1. Die optische Dichte (OD) der Vertiefungen wird bei 450 nm innerhalb von 15
Minuten nach Zugabe der Stopplösung gemessen.
2. Berechnung des mittleren OD450 Wertes des Referenzserums 2 (Vertiefungen
C1 und D1 = OD450 Blindwert).
3. Berechnung der korrigierten OD450 Werte der Proben durch Subtrahieren
des Blindwerts vom mittleren OD450.
4. Berechnung der prozentuale Positivität (PP) des Referenzserums 3 und der
Proben gemäss nachstehender Formel.
Die korrigierten OD450 Werte aller Proben werden als prozentuale Positivität (PP)
im Verhältnis zum korrigierten mittleren OD450 Wert des Referenzserums 1
ausgedrückt.
PP = (Korrigierte OD450 Probe / Korrigierte OD450 Referenz 1) × 100
Auswertung des Ergebnis
Validitätskriterien
1. Die OD450 von Referenz 2 muss <0,350 sein.
2. Die korrigierte OD450 von Referenzserum 1 muss mindestens 0,750 sein.
3. Die PP von Referenz 3 muss >20% sein.
Hinweis: Werden diese Kriterien nicht erfüllt sind die Resultate ungültig und der
Test muss wiederholt werden.
Hinweis: Liegt der mittlere OD450 von Referenzserum 1 unter 0,750, wurde das
Chromogen (TMB) Substrat vermutlich nicht bis auf Raumtemperatur erwärmt.
Erwärmen Sie in diesem Fall die Lösung vorher auf 22±3°C oder inkubieren Sie
das Enzym Substrat bis zu 30 Minuten bevor die Farbreaktion gestoppt wird.
Liegt der korrigierte mittlere OD450 von Referenzserum 1 über 2,000 wird eine
kürzere Inkubation mit dem Chromogen (TMB) Substrat empfohlen.
Auswertung der prozentualen Inhibition
PP = <15%
Negativ
Kein Antigen in der Probe nachweisbar.
PP = ≥15%
Positiv
CSFV Antigen ist in der Probe vorhanden.
Die Anwesenheit von CSFV in Antigen-positiven Proben muss durch
Virusisolation bestätigt werden.
Annexe A - Referenzen
1. Ressang, A.A. (1972). Zbl. Vet. Med. B 20:256–271.
2. Wensvoort et al (1986). Vet. Microbiol. 12:101–108.
3. Kaden et al (1999). Berl. Münch. Tierärtzl. Wschr. 112:52–57.
4. Martin et al (1992). Prev. Vet. Med. 14:33–34.
Annexe B - Probenvorbereitung und Probenlagerung
Es können verschiedne Verfahren angewendet werden um ein Gewebeextrakt für
eine nachfolgede Analyse mittels PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit oder Virus
isolation über Zellkultur zu erhalten. Die nachstehend beschriebenen Verfahren
wurde von holländischen Referenzlabors für CSF des Bundesforschungsinstituts
für Tiergesundheit für die Routinetestung übernommen.
Blut und Plasmaproben
Vollblutproben mit Antikoagulanz (bevorzugt Heparin) oder Plasma sollte nicht
eingefroren werden, sondern bei 5±3°C (max. 7 Tage) gelagert werden.
Serum
Serumproben können direkt oder nach Lagerung bei −70°C getestet werden.
Nach dem Test können die Serumproben bei −70°C gelagert werden (um aktive
Viren zu konservieren).
Herstellung von Gewebeextrakt
1. Schneiden Sie 1–2 Gramm des Gewebes in kleine Stücke und zermahlen
diese zu einer homogenen Paste zusammen mit einer kleinen Menge des
Mediums mit einem Mörser und Pistill. Wenn nötig verwenden Sie sterilen
Sand als Schleifmittel.
2. Geben Sie pro Gramm Gewebe 9 ml Earle’s MEM (ergänzt mit dem 5-fachen
der normalen Konzentration an antibiotischem Streptomycin, Penicillin und
Mycostatin) zu.
3. Inkubieren Sie es 1 Stunde bei 22±3°C.
4. Zentrifugieren Sie die Suspension 20±1 Minuten bei 6000 × g.
5. Ziehen Sie vorsichtig den Überstand ab und verwerfen Sie das Sediment.
6. Verteilen Sie die Suspension in mindestens 2 Fläschchen.
7. Lagern Sie die Fläschchen bei −70°C.
Herstellung des Leukozytenkonzentrats
Vor dem Testen sollten die gesammelte Leukozytenfraktion einer Blutprobe
eingefroren (−20ºC) und wieder aufgetaut werden.
1. 8 ml einer 0,83%-igen NH4Cl-Lösung in ein 15 ml Röhrchen zugeben.
2. Fügen Sie 4 ml antikoaguliertes Vollblut zu.
3. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens und inkubieren Sie 30 Minuten bei
22±3°C um eine vollständige Auflösung der roten Blutkörperchen zu erhalten.
4. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 500 × g bei 22±3°C.
5. Verwerfen Sie den Überstand.
6. Suspendieren Sie das Leukozytenpellet wieder in 400 µl Earle’s MEM
(ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum und antibiotischem Streptomycin,
Penicillin und Mycostatin).
7. Lagern Sie die Probe bei −70°C (um aktive Viren zu konservieren).
Kundendienst und technischer Support
Besuchen Sie thermofisher.com/askaquestion, um technischen Support zu erhalten.
Aktuelles zum Kundendienst und technischen Support finden Sie unter
thermofisher.com/support, darunter:
• Telefonnummern von Ansprechpartnern weltweit
• Bestellungs- und Web-Support
• Betriebsanweisungen, Handbücher und Protokolle
• Analysezertifikate
• Sicherheitsdatenblätter (SDB)
HINWEIS: Wenden Sie sich für Sicherheitsdatenblätter für Reagenzien und
Chemikalien anderer Hersteller an den jeweiligen Hersteller.
Beschränkte Gewährleistung
Die Life Technologies Corporation bzw. ihre verbundenen Unternehmen räumt
dem Käufer für ihre Produkte Gewährleistungsrechte wie in den Allgemeinen
Verkaufsbedingungen von Life Technologies beschrieben ein, die auf der
Website von Life Technologies unter thermofisher.com/
us/en/home/global/terms-and-conditions eingesehen werden können. Sollten
Sie Fragen haben, kontaktieren Sie bitte Life Technologies unter
thermofisher.com/support.
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Inhaltliche Änderungen dieses Leitfadens behalten wir uns ohne Ankündigung vor.
HAFTUNGSAUSSCHLUSS: IN DEM GESETZLICH ZUGELASSENEN UMFANG HAFTET LIFE TECHNOLOGIES
UND/ODER SEINE TOCHTERUNTERNEHMEN NICHT FÜR BESONDERE, VERSEHENTLICHE, INDIREKTE,
STRAFBARE, MEHRERE ODER FOLGESCHÄDEN IN VERBINDUNG MIT ODER HERVORGEHEND AUS
DIESEM DOKUMENT, EINSCHLIESSLICH IHRER NUTZUNG DIESES DOKUMENTS.
Versionsgeschichte: Pub. Nr. MAN0013843 (Deutsch)
Ver.
Datum
Beschreibung
A.0 11 März 2019
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