Thermo Fisher Scientific PrioCHECK BHV-1 gB Ab Strip Kit Bedienungsanleitung

Marke
Thermo Fisher Scientific
Modell
PrioCHECK BHV-1 gB Ab Strip Kit
Typ
Bedienungsanleitung
Für tierärztlichen Gebrauch. Ausschließlich für in vitro zu verwenden.
GEBRAUCHSINFORMATION
PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit
ELISA für
in vitro
Nachweis von Antikörpern gegen das Bovine Herpesvirus in Serum und Milch von Kühen
Katalog-Nummer 7610359
Pub. Nr. MAN0013867 Version A.0
ACHTUNG! Bitte die Sicherheitsdatenblätter (SDB) lesen und Handlungsanweisungen befolgen. Es ist angemessene persönliche Schutzausrüstung
(PSA) zu tragen (Brille, Kleidung, Handschuhe). Die Sicherheitsdatenblätter (SDB) sind abzurufen unter thermofisher.com/support.
ACHTUNG! POTENZIELLE BIOGEFAHR. Informieren Sie sich auf der jeweiligen Produktwebsite (unter thermofisher.com) über biologische
Gefahren, die von dem Produkt ausgehen können. Tragen Sie eine geeignete Schutzbrille sowie Schutzkleidung und -handschuhe.
Einführung
Das Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1), das zur Unterfamilie der Alphaherpesviridae gehört, kann eine breite Vielfalt an Symptomen verursachen, darunter auch die
infektiöse Bovine Rhinotracheitis (IBR), die infektiöse pustuläre Vulvovaginitis (IPV) und die infektiöse pustuläre Balanoposthitis. Nach einer Infektion wird die
Latenz des Virus ermittelt. Als Folge von Stresssituationen kann das latente Virus reaktiviert werden und in unregelmässigen Zeitabständen ausgeschieden werden.
Da der Nachweis latenter BHV1-Träger in Kontrollprogrammen und im internationalen Handel wichtig ist, müssen Tests zum Nachweis spezifischer
Antikörper in Serum hoch empfindlich sein. Zu diesem Zweck wurde ein einfacher, spezifischer und hoch empfindlicher gB ELISA entwickelt (Applied
Biosystems™ PrioCHECK™ BHV−1 gB Ab Strip Kit).
Der PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit weist Antikörper nach, die gegen das Oberflächenglykoprotein B von BHV-1 gerichtet sind. Beim Testen
unverdünnter Rinderserumproben zum Nachweis niedriger Antikörpergehalte ist der PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit ELISA dem 24-Stunden
Neutralisationstest überlegen. Beim Testen von Tankwarenproben von Milch, ist der PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit ein einfaches und passendes
Mittel um den Infektionsstatus einer Herde zu ermitteln.
Testprinzip
Der PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit ist ein Blocking-ELISA. Testplatten wurden mit BHV-1-Antigen beschichtet. Unverdünnte und verdünnte
Serumproben oder unverdünnte entfettete Milchproben (Tankware) werden über Nacht in den Wells einer BHV-1-Antigen beschichteten ELISA-Platte
inkubiert. Während dieser Inkubationszeit reagieren BHV-1-spezifische Antikörper in der Probe, falls vorhanden, spezifisch mit dem BHV-1 Antigen. Nach
dieser Inkubation, werden die Platten gewaschen und mit Peroxidase-konjugiertem mAk (anti-BHV1-gB) inkubiert. Als nächstes wird nicht gebundenes
Material durch Waschen entfernt und das gebrauchsfertige Chromogen (TMB) Substrat zu den Wells gegeben.
Schliesslich wird die Farbentwicklung gestoppt und bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.
Komponenten des Testkits
Packung mit 5 Platten für 440 Proben. Das Kit soll bis zum Verfallsdatum
bei 5±3°C aufbewahrt werden. Siehe Kit-Etikett für jeweiliges
Verfallsdatum. Die Haltbarkeit verdünnter, geöffneter oder rekonstituierter
Komponenten ist nachstehend gegebenenfalls vermerkt.
Komponente
Komponente 1: Testplatte
Komponente 2:
Konjugat (30x)
Fläschchen enthält 2,5 ml Konjugat. Erst kurz vor
Gebrauch verdünnen, die Konjugatverdünnung ist
Komponente 3:
Verdünnungspuffer (2x)
Fläschchen enthält 60 ml Verdünnungspuffer.
Haltbarkeit der Verdünnungspuffergebrauchslösung:
Komponente 4:
Waschpuffer (200x)
Fläschchen enthält 60 ml Waschpuffer. Haltbarkeit der
Komponente 5:
Demineralisiertes Wasser
Komponente 6:
Pferdeserum
Pferdeserum enthalten. Haltbarkeit des rekonstituierten
Komponente 7:
Negativkontrolle
Komponente 8:
Schwachpositivkontrolle
Komponente 9:
Positivkontrolle
Komponente 10:
Chromogen (TMB) Substrat
Komponente 11:
Stopplösung
Weitere Kitbestandteile
Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte
Nutzung
Beschreibung(1)
Allgemein
Laborausrüstung gemäss den nationalen Sicherheitsvorschriften.
Inkubation
Microtiterplatten-Inkubator mit Temperaturregelung (mindestens 50°C).
Analysen-
ergebnisse
Plattenleser. Der Leser muss einen geeigneten Filtersatz haben um
die Platten bei 450 nm ablesen zu können.
Optional
Waschgerät.
(1) Sofern nichts Gegenteiliges angegeben wurde, können alle Materialien auf
thermofisher.com bezogen werden.
Ablauf des Tests
Vorsichtsmassnahmen
• Nationale Sicherheitsvorschriften müssen befolgt werden.
• Der PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit muss in für diesen Zweck
geeigneten Laboratorien durchgeführt werden.
• Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet werden und alle mit
den Proben in Berührung kommenden Gegenstände als potentiell
kontaminiert erachtet werden.
Hinweise
Um optimale Ergebnisse mit dem PrioCHECK™ BHV-1 gB Ab Strip Kit zu
erhalten, müssen folgende Hinweise beachtet werden:
• Das Testverfahren muss streng eingehalten werden.
• Alle Reagenzien des Kits müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur
(22±3°C) gebracht werden.
• Pipettenspitzen müssen nach jedem Pipettierschritt gewechselt werden.
• Für jedes Reagenz müssen eigene Behälter verwendet werden.
• Kitbestandteile dürfen nach ihrem Verfallsdatum, oder wenn Änderungen
in ihrem Aussehen festgestellt werden, nicht mehr verwendet werden.
• Kitbestandteile verschiedener Kit-Chargennummern dürfen nicht
zusammen verwendet werden.
• Demineralisiertes Wasser oder Gleichwertiges für den Test verwenden.
Vorbereitung der Lösungen
Verdünnungspuffergebrauchslösung
Der konzentrierte Verdünnungspuffer (2x) (Komponente 3) muss 1:2 in
demineralisiertem Wasser verdünnt werden. Je Testplatte 24 ml zubereiten
(12 ml Verdünnungspuffer (2x) und 12 ml demineralisiertes Wasser).
Stabilität der Verdünnungspuffergebrauchslösung: 4 Stunden bei 22±3°C.
Pferdeserum
Rekonstituieren des Pferdeserums (Komponente 6) mit 2,5 ml
Demineralisiertem Wasser (Komponente 5). Nach dem rekonstituieren bis
zum Verfallsdatum bei −20°C lagern.
Das rekonstituieren der lyophilisierten Reagenzien:
1. Die Fläschchen auf Raumtemperatur (22±3°C) bringen.
2. Fläschchen aufrecht halten und leicht gegen die Arbeitsfläche schlagen
um sicherzustellen, dass sich der Inhalt auf dem Boden des Fläschchens
befindet.
3. Fläschchen öffnen.
4. Angegebene Menge an Demineralisiertem Wasser zufügen.
5. Stöpsel wieder auf das Fläschchen setzen und das Fläschchen
vorsichtig schwenken, damit sich restliches trockenes Material auflöst.
6. Lyophilisiertes Material 15 Minuten bei 22±3°C stehen lassen.
7. Gelegentlich Fläschchen behutsam umdrehen (Schaumbildung muss
vermieden werden).
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thermofisher.com
8 März 2019
ELISA-Puffer
Rekonstituiertes Pferdeserum zur Verdünnungspuffergebrauchslösung
zugeben bis eine Endkonzentration von 10% (v/v) erreicht ist. Je Testplatte
24 ml zubereiten (2,4 ml Pferdeserum und 21,6 ml Verdünnungspufferge-
brauchslösung). Nicht verwendeter ELISA-Puffer kann bis zu 24 Stunden
bei 5±3°C aufbewahren werden.
Konjugatverdünnung
Verdünnung des Konjugats (30x) (Komponente 2) 1:30 mit ELISA-Puffer
zubereiten. Für eine Platte 10,5 ml zubereiten.
Hinweis: Die Konjugatverdünnung ist nicht stabil, erst kurz vor der
Verwendung anfertigen.
Waschlösung
Der Waschpuffer (200x) (Komponente 4) muss 1:200 mit demineralisiertem
Wasser verdünnt werden und reicht für ein Endvolumen von 12 Liter
Waschlösung.
Stabilität der Waschlösung: eine Woche bei 22±3°C.
Hinweis: Es können kommerzielle ELISA-Waschgeräte verwendet werden.
Falls diese nicht zur Verfügung stehen können die Platten durch pipettieren
von 200–300 µl Waschlösung in jedes Well der Platte gewaschen werden.
Danach die Platte entleeren und den Vorgang so oft wie vorgeschrieben
wiederholen. Die Platte muss zwischen dem Waschen nicht eingeweicht
werden. Die Platte nach dem letzten Waschen fest ausklopfen.
Hinweis: Siehe Anhang B für Verfahren zur Probengewinnung und
Lagerung.
Tag 1: Inkubation der Proben in Antigen-beschichteten Wells
1. 100 µl ELISA-Puffer in die Wells A1 und B1 der Testplatte
(Komponente 1) pipettieren.
2. 100 µl der Negativkontrolle (Komponente 7) in die Wells C1 und D1
pipettieren.
3. 100 µl der Schwachpositivkontrolle (Komponente 8) pipettieren.
4. 100 µl der Positivkontrolle (Komponente 9) in die Wells G1 und H1
pipettieren.
5. 100 µl der Proben in die restlichen Wells pipettieren.
- Serumproben können unverdünnt, oder titriert durch serielle 2-fach
Verdünnung in ELISA-Puffer, getestet werden.
- Entfettete Milchproben müssen unverdünnt getestet werden.
6. Testplatte mit beiliegenden Abdeckfolien abdecken.
7. Über Nacht inkubieren (16–18 Stunden) bei 37±1°C.
Tag 2: Inkubation mit Konjugat und Chromogen (TMB) Substrat
1. Die Testplatte nach der Inkubationszeit ausleeren und die Platte 6 mal
mit 200–300 µl Waschlösung waschen. Die Platte nach dem letzten
Waschen fest ausklopfen.
2. 100 µl der Konjugatverdünnung in jedes Well pipettieren.
3. Testplatte mit beiliegenden Folien abdecken.
4. 60±5 Minuten bei 37±1°C inkubieren.
5. Die Testplatte nach der Inkubationszeit ausleeren und die Platte 6 mal
mit 200–300 µl Waschlösung waschen. Die Platte nach dem letzten
Waschen fest ausklopfen.
6. 100 µl Chromogen (TMB) Substrat (Komponente 10) in jedes Well
pipettieren.
7. 15 Minuten bei 22±3°C inkubieren.
8. 100 µl der Stopplösung (Komponente 11) in jedes Well pipettieren.
9. Inhalte der einzelnen Wells der Testplatte vor der Messung mischen.
Hinweis: Mit der Zugabe der Stopplösung 15 Minuten nach dem Befüllen
des ersten Wells mit Chromogen (TMB) Substrat beginnen. Die
Stopplösung in derselben Reihenfolge und mit der gleichen
Geschwindigkeit wie das Chromogen (TMB) Substrat zugeben.
Ablesen des Tests und Berechnung der Ergebnisse
1. Messung der optischen Dichte (OD) der Wells bei 450 nm, vorzugsweise
innerhalb von 15 Minuten nach Beendung der Farbentwicklung.
2. Den mittleren OD450-Wert der Wells A1 und B1 (= OD450 max) berechnen.
3. Die prozentuale Inhibition (PI) der Kontrollen und der Testseren
werden gemäss nachstehender Formel berechnet:
Hinweis: Die OD450-Werte aller Proben werden als Prozentuale Inhibition
(PI) im Verhältnis zur OD450 max ausgedrückt.
PI = 100 − (OD450 Probe / OD450 max) × 100
Auswertung des Ergebnis
Validitätskriterien
1. Die mittlere OD450 max muss >1,000 sein.
2. Die mittlere prozentuale Inhibition der Negativkontrolle muss <40% sein.
3. Die mittlere prozentuale Inhibition der Schwachpositivkontrolle muss
>40% sein.
4. Die mittlere prozentuale Inhibition der Positivkontrolle muss >70% sein.
Wird eines der Kriterien nicht erfüllt so ist die Platte ungültig.
Hinweis: Falls die OD450 einer Probe grösser als die OD450 max ist, kann die
Prozentuale Inhibition mit 0% gewertet werden.
Wenn die OD450 max unter 1,000 liegt, ist das Chromogen (TMB) Substrat
vermutlich zu kalt. In diesem Fall die Lösung vorher auf 22±3°C erwärmen
oder bis zu 30 Minuten inkubieren.
Wenn die OD450 max über 2,000 liegt wird eine kürzere Inkubationszeit mit
dem Chromogen (TMB) Substrat empfohlen.
Auswertung der prozentualen Inhibition
PI = <40%
Negativ für BHV-1 spezifische Antikörper.
PI = ≥40%
Positiv für BHV-1 spezifische Antikörper.
Hinweis: Falls Serumproben titriert wurden wird der Antikörpertiter einer
Probe als der Kehrwert der höchsten Verdünnung, die eine PI >40% ergibt,
definiert.
Anhang A – Referenzen
1. Ackermann M, Belak S, Bitsch V, Edwards S, Moussa A, Rockborn G,
Thiry E (1990). Vet Microbiol 23:361–363.
2. Kramps JA, Magdalena J, Quak J, Weerdmeester K, Kaashoek MJ,
Maris-Veldhuis MA, Rijsewijk FAM, Keil G, van Oirschot JT (1994). J of
Clin Microbiol 2175–2181.
3. Kramps JA, Perrin B, Edwards S, van Oirschot JT (1996). Vet Microbiol
53:153–161.
Anhang B – Probengewinnung und Lagerung
Serum
• Serumproben können vor dem Test bei −20°C gelagert werden.
• Beim Titrieren von Serumproben müssen 2-fache Verdünnungen in
ELISA-Puffer zubereitet werden.
Milch
• Zum entfetten der Milchproben müssen diese für 15 Minuten bei
1000 × g zentrifugiert werden, egal ob sie ein Konservierungsmittel
(z.B. Azid) enthalten oder nicht. Anstatt zu zentrifugieren können die
Proben auch während mindestens 16 Stunden im Kühlschrank gelagert
werden. Die entfettete Probe wird dann mit einer Pasteurpipette
vorsichtig unterhalb der Rahmschicht entnommen.
• Vor dem Testen können Milchproben bei −20°C gelagert werden
(sofern sie sorgfältig entfettet wurden). Wenn ein Konservierungsmittel
(z.B. Azid) zugegeben wird können Milchproben auch mehrere Tage
bei 5±3°C gelagert werden.
Kundendienst und technischer Support
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Aktuelles zum Kundendienst und technischen Support finden Sie unter
thermofisher.com/support, darunter:
• Telefonnummern von Ansprechpartnern weltweit
• Bestellungs- und Web-Support
• Betriebsanweisungen, Handbücher und Protokolle
• Analysezertifikate
• Sicherheitsdatenblätter (SDB)
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und Chemikalien anderer Hersteller an den jeweiligen Hersteller.
Beschränkte Gewährleistung
Die Life Technologies Corporation bzw. ihre verbundenen Unternehmen
räumt dem Käufer für ihre Produkte Gewährleistungsrechte wie in den
Allgemeinen Verkaufsbedingungen von Life Technologies beschrieben ein,
die auf der Website von Life Technologies unter thermofisher.com/
us/en/home/global/terms-and-conditions eingesehen werden können.
Sollten Sie Fragen haben, kontaktieren Sie bitte Life Technologies unter
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UND/ODER SEINE TOCHTERUNTERNEHMEN NICHT FÜR BESONDERE, VERSEHENTLICHE, INDIREKTE,
STRAFBARE, MEHRERE ODER FOLGESCHÄDEN IN VERBINDUNG MIT ODER HERVORGEHEND AUS
DIESEM DOKUMENT, EINSCHLIESSLICH IHRER NUTZUNG DIESES DOKUMENTS.
Versionsgeschichte: Pub. Nr. MAN0013867 (Deutsch)
Ver.
Datum
Beschreibung
A.0 8 März 2019
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