Thermo Fisher Scientific PrioCHECK FMDV type O serum cattle sheep goat pig 7610430 Benutzerhandbuch

Marke: Thermo Fisher Scientific

Modell: PrioCHECK FMDV type O serum cattle sheep goat pig 7610430

Typ: Benutzerhandbuch

PrioCHECK® FMDV type O

ELISA für in vitro Nachweis von Antikörpern gegen Maul- und Klauenseuche-Virus vom Serotyp O in Serum von Rindern,

Schafen, Ziegen und Schweinen

Packung mit 2 Platten für 176 Proben

©Prionics AG

Version 1.4_d

Nur für in-vitro Veterinärdiagnostik

Bei 5±3°C lagern

Produkt-Nr.:7610430

Für Deutschland: Zulassungsnummer FLI-B 469

Einführung

Maul- und Klauenseuche (MKS) ist weltweit die

folgenschwerste ökonomische Bedrohung in der

Tierhaltungsindustrie. Diese hoch ansteckende

Krankheit befällt alle Paarhufer und ist auf der ganzen

Welt verbreitet.1

Der Internationale Standardtest zum Nachweis von

Antikörper ist der Virusneutralisationstest (OIE

Handbuch), jedoch ist der Test umständlich und muss

in Hochsicherheitslaboratorien durchgeführt werden.

Daher wurden verschiedene ELISA’s entwickelt.2,3,4,5,6

Die meisten dieser ELISA’s nutzen jedoch polyklonale

Seren, sind Spezies spezifisch und zeitaufwendig, was

ihre Eignung für eine Massenuntersuchung und

Reproduzierbarkeit beeinträchtigt. Daher basiert der

PrioCHECK® FMDV type O auf monoklonalen

Antikörpern (mAk’s) für Rinder, Schweine, Ziegen und

Schafe. Der Test wurde auf ein Minimum an

Reaktionsschritten ausgelegt, erlaubt

Massenuntersuchungen und ist für automatische

ELISA Roboter geeignet.

Testprinzip

Der PrioCHECK® FMDV type O ist ein Blocking-ELISA

und weist Antikörper (Ak) gegen das Maul- und

Klauenseuche-Virus (Englisch: FMDV) vom Serotyp O

nach. Die Reaktion zwischen dem Antigen vom FMDV

type O und einem spezifischen monoklonalen

Antikörper (mAk), wird durch spezifische in der Probe

vorhandene Antikörper blockiert.

Eine Mikrotiterplatte wird mit nicht-infektiösem FMDV

vom Antigen type O beschichtet. Puffer und

unverdünntes Serum werden in die Wells gegeben.

Die Platte wird bei Raumtemperatur (22±3°C)

inkubiert. Nach dem Waschen wird mAk-HRP

Konjugat zur Platte gegeben und die Testplatte wird

bei 22±3°C inkubiert. Die Platte wird gewaschen und

Chromogen (TMB) Substrat zugegeben. Nach der

Inkubation wird die Farbentwicklung durch Zugabe

einer Stopplösung gestoppt und die optische Dichte

(OD) wird bei 450 nm gemessen.

Komponenten des Testkits

Das Kit soll bis zum Verfallsdatum bei 5±3°C

aufbewahrt werden. Siehe Kit-Etikette für jeweiliges

Verfallsdatum. Die Haltbarkeit verdünnter, geöffneter

oder rekonstituierter Komponenten ist gegebenenfalls

nachstehend vermerkt. Chemische Gefahrstoffdaten

liegen in Abschnitt „Sicherheitsvorschriften und R&S

Angaben“ (Anhang II) gelistet.

Komponente 1

Testplatte

Zwei Streifen-Testplatten.

Komponente 2

Konjugat (30x)

Ein Fläschchen enthält 2,5 ml Konjugat.

Verdünntes Konjugat ist nicht stabil, kurz vor der

Verwendung zubereiten.

Komponente 3

Verdünnungspuffer (5x)

(5x konzentriert, vor dem Gebrauch verdünnen). Ein

Fläschchen enthält 60 ml Verdünnungspuffer.

Haltbarkeit der Verdünnungspuffer-Gebrauchslösung:

4 Stunden bei 22±3°C.

Komponente 4

Pferdeserum (lyophilisiert)

(Rekonstituieren, vor dem Gebrauch verdünnen)

Ein Fläschchen mit 3,5 ml Pferdeserum.

Haltbarkeit des rekonstituierten Pferdeserums: bis zum

Verfallsdatum bei -20°C.

Komponente 5

Demineralisiertes Wasser

Ein Fläschchen enthält 10 ml Demineralisiertes

Wasser.

Komponente 6

Waschpuffer (200x)

(200x konzentriert, vor dem Gebrauch verdünnen). Ein

Fläschchen enthält 60 ml Waschpuffer.

Haltbarkeit der Waschlösung: 1 Woche bei 22±3°C.

Komponente 7

Positivkontrolle (gebrauchsfertig)

Ein Fläschchen enthält 0,5 ml Positivkontrolle.

Komponente 8

Schwachpositivkontrolle (gebrauchsfertig)

Ein Fläschchen enthält 0,5 ml

Schwachpositivkontrolle.

Komponente 9

Negativkontrolle Hoch (gebrauchsfertig)

Ein Fläschchen enthält 0,5 ml Negativkontrolle Hoch.

Komponente 10

Negativkontrolle (gebrauchsfertig)

Ein Fläschchen enthält 0,5 ml Negativkontrolle.

Komponente 11

Chromogen (TMB) Substrat (gebrauchsfertig)

Ein Fläschchen enthält 60 ml Chromogen (TMB)

Substrat.

Komponente 12

Stopplösung (gebrauchsfertig)

Ein Fläschchen enthält 60 ml Stopplösung.

Weitere Kitbestandteile:

- Gebrauchsinformation

- 1 Deckel um die Streifen während der Inkubation

abzudecken

- Analysezertifikat

Zusätzlich benötigte Materialien und

Geräte

Allgemein:

Laborausrüstung gemäss den nationalen

Sicherheitsvorschriften.

Analyseergebnisse:

Platten-Photometer, z.B. Multiscan EX oder

gleichwertig.

Das Gerät muss einen geeigneten Filtersatz haben um

die Platten bei 450 nm ablesen zu können.

Optional:

Plattenwascher, z.B. Tecan EIA Plattform oder

gleichwertig.

Ablauf des Tests

Vorsichtsmassnahmen

Beim Arbeiten mit Tierproben müssen nationale

Richtlinien streng befolgt werden. Der PrioCHECK®

FMDV type O muss in für diesen Zweck geeigneten

Laboratorien durchgeführt werden

Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet

werden und alle mit den Proben in Berührung

kommenden Gegenstände als potentiell kontaminiert

erachtet werden.

Chemische Gefahrstoffdaten liegen in Abschnitt

„Sicherheitsvorschriften und R&S Angaben“ (Anhang

II) vor.

Hinweise

Um optimale Ergebnisse mit dem PrioCHECK® FMDV

type O zu erhalten, müssen folgende Hinweise

beachtet werden:

 Das Protokoll des Testverfahrens muss

streng eingehalten werden.

 Alle Reagentien des Kits müssen vor Gebrauch

auf Raumtemperatur (22±3°C) gebracht werden.

 Pipettenspitzen müssen nach jedem

Pipettierschritt gewechselt werden.

 Für jedes Reagenz muss ein eigenes

Reagenzreservoir verwendet werden.

 Kitbestandteile dürfen nach ihrem Verfallsdatum,

oder wenn Änderungen in ihrem Aussehen

festgestellt werden, nicht mehr verwendet

werden.

 Kitbestandteile verschiedener Kit-

Chargennummern dürfen nicht zusammen

verwendet werden.

 Demineralisiertes Wasser oder gleichwertiges für

den Test verwenden.

VORBEREITUNG DER LÖSUNGEN

Verdünnungspuffer-Gebrauchslösung

Verdünnungspuffer (5x) (Komponente 3) 5-fach in

demineralisiertem Wasser verdünnen. (1 Volumina

Verdünnungspuffer + 4 Volumina demineralisiertes

Wasser). Kann bis zu 4 Stunden bei 22±3°C

aufbewahrt werden.

Pferdeserum

Das Pferdeserum (Komponente 4) auf 22±3°C

bringen. Das lyophilisierte Pferdeserum wird mit 3,5 ml

demineralisiertem Wasser (Komponente 5)

rekonstituiert

. Kann bis zum Verfallsdatum bei -20°C

aufbewahrt werden.

ELISA-Puffer

Das Pferdeserum mit Verdünnungspuffer-

Gebrauchslösung zu einer Endkonzentration von 5%

(v/v) verdünnen; für 2 Reihen werden 3,5 ml benötigt

(175 µl Pferdeserum und 3,325 ml Verdünnungspuffer-

Gebrauchslösung mischen). Der ELISA-Puffer kann

bis zu 4 Stunden bei 22±3°C aufbewahrt werden.

Konjugatverdünnung

Konjugat (30x) (Komponente 2) 1/30 in ELISA-Puffer

verdünnen; z.B.: für zwei Reihen 1,8 ml herstellen (60

µl Konjugat (30x) und 1,74 ml ELISA-Puffer mischen).

Die Konjugatverdünnung erst kurz vor der

Verwendung herstellen.

Rekonstituierung des lyophilisierten Pferdeserums muss wie folgt

durchgeführt werden:

- Fläschchen auf 22±3°C bringen.

- Fläschchen aufrecht halten und leicht gegen die Arbeitsfläche

schlagen um sicherzustellen, dass sich der Inhalt auf dem Boden des

Fläschchens befindet.

- Fläschchen vorsichtig öffnen.

- Angegebene Menge an demineralisiertem Wasser (Komponente 5)

zufügen.

- Stöpsel wieder auf das Fläschchen setzen und warten bis sich

lyophilisiertes Material aufgelöst hat.

- Fläschchen behutsam schütteln, damit sich restliches trockenes

Material auflöst.

- Material vor dem Gebrauch mindestens 15 Minuten bei 22±3°C

stehen lassen.

- Vorsichtig und mit Unterbrechungen mischen (Schaumbildung

vermeiden).

Gebrauchsinformation

Die deutsche Gebrauchsinformation ist

nach § 17c TierSG zugelassen

PrioCHECK® FMDV type O

Waschlösung

Konzentrierter Waschpuffer (200x) (Komponente 6) in

demineralisiertem Wasser auf das 200-fache

verdünnen. Die Menge an konzentriertem Waschpuffer

reicht um insgesamt 12 Liter herzustellen.

Stabilität der Waschlösung: 1 Woche bei Lagerung bei

22±3°C.

Zu Beachten: Es kann ein kommerzielles ELISA-Waschgerät

verwendet werden. Falls ein solches nicht zur Verfügung steht,

kann die Testplatten durch Zugabe von 200 - 300 µl

Waschlösung in alle Wells der Testplatte gewaschen werden.

Danach wieder ausleeren und den Vorgang so oft wie

vorgeschrieben wiederholen. Die Testplatte muss zwischen

dem Waschen nicht eingeweicht werden. Testplatte nach dem

letzten Waschschritt fest ausklopfen.

INKUBATION DES SERUMS

1.1 90 µl ELISA-Puffer in alle Wells der Testplatte

(Komponente 1) vorlegen.

1.2 10 µl der Positivkontrolle (Komponente 7) in die

Wells A1 und B1 pipettieren.

1.3 10 µl der Schwachpositivkontrolle (Komponente

8) in die Wells C1 und D1 pipettieren.

1.4 10 µl der Negativkontrolle Hoch (Komponente

9) in die Wells E1 und F1 pipettieren.

1.5 10 µl der Negativkontrolle (Komponente 10) in

die Wells G1 und H1 pipettieren.

1.6 10 µl der Serumproben in die restlichen Wells

pipettieren.

1.7 Testplatte abdecken und leicht schütteln.

1.8 Während 60±5 min bei 22±3°C inkubieren.

1.9 Platte nach der Inkubation leeren und 6-mal mit

200 bis 300 µl Waschlösung waschen. Platte

nach dem letzten Waschschritt fest ausklopfen.

INKUBATION MIT KONJUGAT

2.1 100 µl des verdünnten Konjugats in alle Wells

zugeben.

2.2 Platte abdecken und leicht schütteln.

2.3 60±5 min bei 22±3°C inkubieren.

INKUBATION MIT CHROMOGEN (TMB) SUBSTRAT

3.1. Platte nach der Inkubation leeren und 6-mal mit

200 bis 300 µl Waschlösung waschen. Platte

nach dem letzten Waschschritt fest ausklopfen.

3.2. 100 µl Chromogen (TMB) Substrat (Komponente

11) in alle Wells zugeben.

3.3. 15 min bei 22±3°C inkubieren.

3.4. 100 µl Stopplösung (Komponente 12) zugeben.

3.5. Inhalt der einzelnen Wells auf der Testplatte

mischen.

Hinweis: Mit der Zugabe der Stopplösung 15 Minuten nach

dem Befüllen des ersten Wells mit Chromogen (TMB) Substrat

beginnen. Stopplösung in derselben Reihenfolge und mit der

gleichen Geschwindigkeit wie das Chromogen (TMB) Substrat

zugeben.

ABLESEN DES TESTS UND BERECHNUNG DER

ERGEBNISSE

4.1. Messen der optische Dichte (OD) der Wells bei

450 nm innerhalb von 15 min nach Beendung

der Farbentwicklung.

4.2. Den Mittelwert der Wells A1 und B1 (OD450 =

Blindwert) berechnen.

4.3. Die korrigierten OD450 aller Proben durch

subtrahieren des mittleren OD450 Blindwerts

berechnen.

4.4. Den Mittelwert der Wells G1-H1 (= OD450 max)

berechnen.

4.5. Die prozentuale Inhibition (PI) der Kontrollen und

der Testseren werden gemäss nachstehender

Formel berechnet.

Die OD450 Werte aller Proben werden als prozentuale

Inhibition (PI) im Verhältnis zur OD450 max

ausgedrückt.

Korrigierte OD450 Testprobe

PI = 100 - ------------------------------------ x 100

Korrigierte OD450 max

AUSWERTUNG DES ERGEBNIS

Validitätskriterien

5.1. Die mittlere OD450 der Wells A1 und B1 (= OD450

Blindwert) muss <0,350 sein.

5.2. Die mittlere korrigierte OD450 max muss

mindestens 1,000 sein.

5.3. Die mittlere prozentuale Inhibition von

Schwachpositivkontrolle muss >60% sein.

5.4. Die mittlere prozentuale Inhibition von

Negativkontrolle Hoch muss <40% sein.

Wird eines der Kriterien nicht erfüllt, sind die

Ergebnisse ungültig und diese Proben müssen

nochmals getestet werden.

Hinweis: Wenn die korrigierte mittlere OD450 unter 1,000 liegt,

ist das Chromogen (TMB) Substrat vermutlich zu kalt.

In diesem Fall sollte die Lösung vorher auf 22±3°C erwärmt

oder bis zu 30 Minuten inkubiert werden.

Auswertung der prozentualen Inhibition

PI = < 50% (Negativ)

Es liegen keine FMDV type O Antikörper in dem

Testserum vor.

PI = >50% (Positiv)

Es liegen FMDV type O Antikörper in dem Testserum

vor.

Anhang I

Hinweis

Diese Gebrauchsinformation gilt als vollständig und richtig zum

Zeitpunkt ihrer Veröffentlichung. Inhalte der

Gebrauchsinformation bedürfen in Deutschland der

Genehmigung durch das Friedrich-Loeffler Institut (FLI).

Prionics AG haftet keinesfalls für Neben- oder Folgeschäden,

die sich im Zusammenhang mit oder in der Folge der

Benutzung dieses Handbuches ergeben.

Haftbarkeit

Prionics AG garantiert, dass seine Produkte die entsprechende

veröffentlichte Spezifikation erfüllen, wenn sie in

Übereinstimmung mit den entsprechenden Anleitungen

verwendet werden und innerhalb der angegebenen

Produktlebensdauer. Prionics AG gibt keine andere Garantie,

weder ausdrücklich noch stillschweigend. Das Unternehmen

übernimmt keinerlei Garantie hinsichtlich der Marktgängigkeit

und Eignung seiner Waren für einen besonderen Zweck. Die

hier erteilte Garantie und die Daten, Spezifikationen und

Beschreibungen der Produkte der Prionics AG, die in den von

Prionics AG herausgegebenen Katalogen auftauchen und in

Informationen zum Produkt kann nicht verändert werden, außer

durch ausdrücklichen schriftlichen Zustimmung durch ein

Vorstandsmitglied der Prionics AG. Mündliche oder schriftliche

Informationen, die nicht mit dieser Garantie übereinstimmen,

oder falls sie weitergegeben werden, sind nicht genehmigt, und

falls sie gegeben werden, sind sie nicht gültig.

Bei Auftreten eines Defektes, der im Rahmen der vorstehenden

Garantiebestimmungen gedeckt ist, besteht für Prionics AG nur

die Verpflichtung, wahlweise das entsprechende Produkt oder

Teile hiervon zu reparieren oder zu ersetzen, wobei es im

Ermessen von Prionics AG liegt, ob das Produkt ersetzt oder

repariert wird. Dem Kunden obliegt es Prionics AG rechtzeitig

über das Auftreten eines solchen Defektes zu informieren.

Wenn Prionics AG das Produkt oder ein Teil davon nicht

innerhalb einer angemessenen Frist reparieren oder ersetzen

kann, wird Prionics AG den Kaufpreis für das Produkt oder

dessen Teil zurückerstatten.

Soweit im Rahmen des anwendbaren Rechts zulässig, ist

Prionics AG nicht ersatzpflichtig für direkte, indirekte,

spezifische, beiläufige oder Folgeschäden durch Verlust oder

Beschädigung infolge der Verwendung seiner Produkte.

Prionics AG und Prionics Lelystad B.V. sind nach ISO

9001:2000 zertifizierte Gesellschaften.

Anhang II

Sicherheitsvorschriften und R&S Sätze

Nationale Sicherheitsvorschriften müssen streng befolgt

werden

R&S Sätze

Komponente 1

Testplatte