Thermo Fisher Scientific PrioCHECK CSFV Erns Ab Strip Kit Bedienungsanleitung

Marke
Thermo Fisher Scientific
Modell
PrioCHECK CSFV Erns Ab Strip Kit
Typ
Bedienungsanleitung
Für tierärztlichen Gebrauch. Ausschließlich für in vitro zu verwenden.
GEBRAUCHSINFORMATION
PrioCHECK™ CSFV Erns Ab Strip Kit
ELISA für
in vitro
Nachweis von Antikörpern gegen das Erns Protein des klassischen Schweinepestvirus im Serum von Schweinen
Katalog-Nummer 7610370
Pub. Nr. MAN0013871 Version
A.0
Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach § 11 Absatz 2 TierGesG zugelassen
Für Deutschland: Zul.Nr: BFAV/KSP/D12/2000
ACHTUNG! Bitte die Sicherheitsdatenblätter (SDB) lesen und Handlungsanweisungen befolgen. Es ist angemessene persönliche Schutzausrüstung
(PSA) zu tragen (Brille, Kleidung, Handschuhe). Die Sicherheitsdatenblätter (SDB) sind abzurufen unter thermofisher.com/support.
ACHTUNG! POTENZIELLE BIOGEFAHR. Informieren Sie sich auf der jeweiligen Produktwebsite (unter thermofisher.com) über biologische
Gefahren, die von dem Produkt ausgehen können. Tragen Sie eine geeignete Schutzbrille sowie Schutzkleidung und -handschuhe.
Einführung
Ein serologischer Test, der Erns-spezifische Antikörper nachweist, kann in Schweinpopulationen, die mit E2-basierten Markerimpfstoffen gegen die
Klassische Schweinepest (KSP) geimpft wurden, zur Detektion von Feldvirusinfektionen eingesetzt werden. Dabei beruht die Diskriminierung auf der
Tatsache, dass KSP-Virus (KSPV, engl. CSFV) infizierte Tiere Antikörper sowohl gegen die Strukturproteine E2 und Erns als auch gegen das
Nichtstrukturprotein NS3 ausbilden. Markergeimpfte Tiere besitzen nur E2-spezifische Antikörper und bleiben negativ in Erns-spezifischen Testsystemen.
Applied Biosystems™ PrioCHECK™ CSFV Erns Ab Strip Kit ist ein empfindlicher und spezifischer Test für die Untersuchung von Serumproben auf
Herdenbasis. Es sollte immer eine angemessene Anzahl Tiere pro Herde untersucht werden.
Testprinzip
Der PrioCHECK™ CSFV Erns Ab Strip Kit verwendet zwei unterschiedliche monoklonale Antikörper (mAks), die gegen verschiedene Epitope des
Erns-Proteins von CSFV gerichtet sind. Der Test basiert auf dem Blockieren (durch spezifische Serumantikörper) der Bindung zwischen Erns-spezifischen
mAks und dem Erns Protein.
Testseren werden mit CSFV-Erns-Antigen in den Vertiefungen einer nicht beschichteten Mikrotiterplatte vorinkubiert. Während der Vorinkubation
reagieren CSFV-Erns spezifische Antikörper in den Proben, falls vorhanden, spezifisch mit dem Erns Antigen.
Nach der Vorinkubation werden die mit Antigen versetzten Serumproben, zusammen mit einem HRP konjugierten mAk (anti-Erns „mAk 1“) in eine mit
mAk (anti-Erns „mAk 2“) beschichteten ELISA-Platte gegeben und inkubiert. Danach wird nicht gebundenes Material durch Waschen entfernt und
Chromogen (TMB) Substrat zu der Platte gegeben. Schliesslich wird die Farbentwicklung gestoppt und bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.
Komponenten des Testkits
Packung mit 5 Platten für 440 Proben. Das Kit soll bis zum Verfallsdatum
bei 5±3°C aufbewahrt werden.
Siehe Kit-Etikett für das jeweilige Verfallsdatum. Die Haltbarkeit
verdünnter, geöffneter oder rekonstituierter Komponenten ist, wo nötig,
nachstehend vermerkt.
Komponente
Beschreibung
1: Testplatte
Fünf Testplatten werden in Beuteln, die ein
Trocknungsmittel enthalten, geliefert.
2: Konjugat (30x)
30x konzentriert, vor Gebrauch verdünnen. Ein
Fläschchen enthält 1,5 ml Konjugat. Erst kurz vor
Gebrauch verdünnen; Konjugatverdünnung ist nicht
stabil.
3: Verdünnungs-
puffer (5x)
5x konzentriert, vor Gebrauch verdünnen. Eine Flasche
enthält 60 ml Verdünnungspuffer.
Haltbarkeit der Verdünnungspuffergebrauchslösung:
4 Stunden bei 22±3°C.
4: Pferdeserum
Lyophilisiert. Zwei Fläschchen mit je 3,5 ml
lyophilisiertes Pferdeserum. Haltbarkeit des
rekonstituierten Pferdeserums: bei −20°C bis zum
Verfallsdatum.
5: Antigen (10x)
10x konzentriert, vor Gebrauch verdünnen. Ein
Fläschchen enthält 4,0 ml Antigen. Haltbarkeit des
verdünnten Antigens: 4 Stunden bei 22±3°C.
6: Demineralisiertes
Wasser
Ein Fläschchen enthält 10 ml demineralisiertes
Wasser.
7: Waschpuffer
(200x)
200x konzentriert, vor Gebrauch verdünnen. Eine
Flasche enthält 60 ml Waschpuffer.
Haltbarkeit der Waschlösung: 1 Woche bei 22±3°C.
8: Negativkontrolle
Gebrauchsfertig. Ein Fläschchen enthält 1,0 ml
Negativkontrolle.
9: Validierungskon-
trolle
Gebrauchsfertig. Ein Fläschchen enthält 1,0 ml
Validierungskontrolle.
10: Positivkontrolle
Gebrauchsfertig. Ein Fläschchen enthält 1,0 ml
Positivkontrolle.
11: Chromogen
(TMB) Substrat
Gebrauchsfertig. Eine Flasche enthält 60 ml
Chromogen (TMB) Substrat.
12: Stopplösung
Gebrauchsfertig. Eine Flasche enthält 60 ml
Stopplösung.
Weitere
Kitbestandteile
• Gebrauchsinformation
• 10 Abdeckfolien
Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte
Schritt
Beschreibung(1)
Blindplatten
Blindplatten zum vorinkubieren der Seren und Kontrollen
mit dem Antigen. Wir empfehlen U-Boden Platten
(Kat.-Nr. 267245). Es können jedoch auch andere nicht
bindende Platten oder Röhrchen verwendet werden.
Allgemein
Laborausrüstung gemäss den nationalen
Sicherheitsvorschriften.
Auswertung
Platten Fotometer. Das Fotometer muss mit einem
geeigneten Filtersatz ausgerüstet sein, um die Absorption
bei 450 nm messen zu können.
Optional
Plattenwascher.
(1) Sofern nichts Gegenteiliges angegeben wurde, können alle Materialien auf
thermofisher.com bezogen werden.
Ablauf des Tests
Vorsichtsmassnahmen
• Nationale Sicherheitsvorschriften müssen befolgt werden.
• Der PrioCHECK™ CSFV Erns Ab Strip Kit muss in Laboratorien
durchgeführt werden, die für diesen Zweck geeignet sind.
• Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet werden und alle mit
den Proben in Berührung kommenden Gegenstände als potentiell
kontaminiert erachtet werden.
Hinweise
Um optimale Ergebnisse mit dem PrioCHECK™ CSFV Erns Ab Strip Kit zu
erhalten, müssen folgende Aspekte beachtet werden:
• Das Testverfahren muss streng eingehalten werden.
• Alle Reagenzien des Kits müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur
(22±3°C) gebracht werden.
• Pipettenspitzen müssen nach jedem Pipettierschritt gewechselt werden.
• Für jedes Reagenz müssen eigene Behälter verwendet werden.
• Kitbestandteile dürfen nach ihrem Verfallsdatum oder bei einer
Änderung in ihrem Aussehen nicht mehr verwendet werden.
• Komponenten von verschiedenen Kit-chargennummern dürfen nicht
gemischt werden.
• Demineralisiertes Wasser oder Wasser gleicher Qualität verwenden.
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thermofisher.com
27. August 2019
Vorbereitung der Lösungen
Verdünnungspuffergebrauchslösung
Das Verdünnungspuffer (5x) (Komponente 3) muss vor Gebrauch 1:5 in
demineralisiertem Wasser verdünnt werden. Eine Flasche reicht für ein
Endvolumen von 300 ml. Kann bis zu 4 Stunden bei 22±3°C aufbewahrt
werden.
Pferdeserum
Pferdeserum (Komponente 4) auf 22±3°C bringen und mit 3,5 ml
demineralisiertem Wasser (Komponente 6) rekonstituieren.
Das rekonstituierte Pferdeserum kann bis zum Verfallsdatum bei −20°C
aufbewahrt werden.
ELISA Puffer
Das rekonstituierte Pferdeserums 1:20 mit Verdünnungspuffergebrauchs-
lösung verdünnen; für z.B. eine Platte werden 26 ml benötigt (1,3 ml
rekonstituiertes Pferdeserum zu 24,7 ml Verdünnungspuffergebrauchs-
lösung geben). Der ELISA Puffer kann bis zu 4 Stunden bei 22±3°C
aufbewahrt werden.
Antigen
Das Antigen (10x) (Komponente 5) 1:10 mit ELISA Puffer verdünnen; für
z.B. eine Platte werden 8,0 ml benötigt (800 µl Antigen (10x) in 7,20 ml
ELISA Puffer zugeben).
Konjugatverdünnung
Konjugat (30x) (Komponente 2) 1:30 in ELISA Puffer verdünnen; für z.B.
eine Platte wird eine Menge von 6 ml benötigt. Hierzu werden 200 µl
Konjugat (30x) in 5,8 ml ELISA Puffer verdünnt).
Hinweis: Die Konjugatverdünnung darf erst kurz vor ihrer Verwendung
hergestellt werden.
Waschlösung
Der Waschpuffer (200x) (Komponente 7) muss mit demineralisiertem
Wasser 1:200 verdünnt werden. Eine Flasche reicht für ein Endvolumen
von 12 Litern Waschlösung.
Die Waschlösung kann 1 Woche bei 22±3°C aufbewahrt werden.
Zu beachten: Ungenügendes Waschen der Testplatte kann zu hohen
Hintergrundsignalen führen. Die Verwendung eines automatischen
Plattenwaschers ist dem Waschen mit Multikanalpipetten vorzuziehen.
Eine Einwirkzeit zwischen den Waschschritten ist nicht nötig. Ein
minimales Volumen von 200 µl pro Vertiefung ist ausreichend für ein
angemessenes Waschen der Platte.
Inkubation des Antigens, Kontrollproben und Testseren in
Blindplatten
1. Verwenden Sie eine nicht bindende Mikrotiterplatten.
2. 120 µl des ELISA-Puffers in die Vertiefungen A1 und B1 geben.
3. 45 µl des ELISA-Puffers in die restlichen Vertiefungen geben.
4. 30 µl der Negativkontrolle (Komponente 8) in die Vertiefungen A1 bis
D1 geben.
5. 30 µl der Validierungskontrolle (Komponente 9) in die Vertiefungen
E1 und F1 geben.
6. 30 µl der Positivkontrolle (Komponente 10) in die Vertiefungen G1 und
H1 zugeben.
7. 30 µl der Serumproben in die restlichen Vertiefungen geben.
8. Platte auf einem Plattenschüttler leicht schütteln.
9. 75 µl der Antigengebrauchslösung in alle Vertiefungen zugeben ausser
Positionen A1 und B1.
10. Die Platte abdecken und auf einem Plattenschüttler leicht schütteln und
für 30±2 Minuten bei 37±1°C inkubieren.
Inkubation in ELISA Platten
1. Die Testplatte (Komponente 1) erst aus dem Beutel nehmen, nachdem
dieser auf 22±3°C gebracht worden ist.
2. 50 µl Konjugatverdünnung in alle Vertiefungen der Testplatte geben.
3. 50 µl aus jeder Vertiefung der Blindplatte zu den entsprechenden
Vertiefungen auf der Testplatte transferieren.
4. Die Platte abdecken und unter leichtem Schütteln für 60±5 Minuten bei
37±1°C inkubieren.
Inkubation mit Chromogen (TMB) Substrat
1. Die inkubierte Testplatte 6 mal mit 200 bis 300 µl Waschlösung pro
Vertiefung waschen.Die Platte nach dem letzten Waschzyklus fest
ausklopfen.
2. 100 µl Chromogen (TMB) Substrat (Komponente 11) in jede Vertiefung
geben und für 30 Minuten bei 22±3°C inkubieren. Starten sie die
Zeitmessung nachdem die erste Vertiefung befüllt wurde.
3. 100 µl Stopplösung (Komponente 12) in alle Vertiefungen geben.
Hinweis: Die Stopplösung erst 30±5 Minuten nach dem Befüllen der ersten
Vertiefung mit Chromogen (TMB) Substrat zugeben. Stopplösung in
derselben Reihenfolge und mit der gleichen Geschwindigkeit wie das
Chromogen (TMB) Substrat zugeben.
Messen der testplatte und Berechnung der Ergebnisse
1. Die Testplatte leicht schütteln. Die optische Dichte (OD) der
Vertiefungen wird bei 450 nm innerhalb von 15 Minuten nach Zugabe
der Stopplösung gemessen.
2. Berechnung des Mittelwertes der optischen Dichte OD450 der
Vertiefungen A1 und B1. Dies entspricht dem Blindwert.
3. Berechnung der korrigierten OD450 Werte aller Vertiefungen durch
Subtrahieren des OD450 Blindwertes.
4. Berechnung des Mittelwertes der korrigierten OD450 der Vertiefungen
C1 und D1. Dies entspricht dem korrigierten OD450 max.
Die prozentuale Inhibition (PI) der Validierungskontrolle und
Positivkontrolle und der Proben wird gemäss nachstehender Formel
berechnet:
PI = 100 − (Korrigierte OD450 Testprobe / Korrigierte OD450 max) × 100
Auswertung der Ergebnisse
Validitätskriterien
• Der OD450 max Wert muss mindestens 1,000 betragen.
• Der OD450 Blindwert muss <0,200 sein.
• Positivkontrolle muss eine PI von >65% haben.
• Validierungskontrolle muss eine PI von <55% haben.
Hinweis: Wenn der korrigierte OD450 max unter 1,000 liegt, wurde das
Chromogen (TMB) Substrat vermutlich nicht bis auf Raumtemperatur
erwärmt. Erwärmen Sie in diesem Fall die Lösung vorher auf 22±3°C oder
inkubieren bis zu 40 Minuten.
Wenn der korrigierte OD450 max über 2,000 liegt wird eine kürzere
Inkubation mit dem Chromogen (TMB) Substrat empfohlen.
Auswertung der prozentualen Inhibition
PI = ≥40% Positiv
rns
PI = <40% Negativ
Anhang - Referenzen
1. Edwards S, Sands JJ, Harkness JW (1988). Arch Virol 102:197–206.
2. Edwards S, Moennig V, Wensvoort G (1991). Vet Microbiol 29:101-108.
3. Paton DJ, Ibata G, Edwards S, Wensvoort GJ (1991a). Vir Meth
31:315-324.
4. Paton DJ, Sands JJ, Roehe PM (1991b). Arch Virol Suppl 3:47–54.
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• Bestellungs- und Web-Support
• Betriebsanweisungen, Handbücher und Protokolle
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Versionsgeschichte: Pub. Nr. MAN0013871 (Deutsch)
Ver.
Datum
Beschreibung
A.0 27. August 2019
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• Der Produktname wurde von PrioCHECK® CSFV Ern s in PrioCHECK™
CSFV E
rns
Ab Strip Kit geändert.
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