Thermo Fisher Scientific PrioCHECK Porcine Parvovirus Ab Plate Kit Bedienungsanleitung

Marke
Thermo Fisher Scientific
Modell
PrioCHECK Porcine Parvovirus Ab Plate Kit
Typ
Bedienungsanleitung
Für tierärztlichen Gebrauch. Ausschließlich für in vitro zu verwenden.
GEBRAUCHSINFORMATION
PrioCHECK™ Porcine Parvovirus Ab Plate Kit
ELISA für den
in vitro
Nachweis von Antikörpern gegen das Porzine Parvovirus in Serum von Schweinen
Katalog-Nummer 7588981
Pub. Nr. MAN0013811 Version A.0
Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach § 17c TierSG zugelassen
Für Deutschland: Zulassungsnummer FLI-B
ACHTUNG! Bitte die Sicherheitsdatenblätter (SDB) lesen und Handlungsanweisungen befolgen. Es ist angemessene persönliche Schutzausrüstung
(PSA) zu tragen (Brille, Kleidung, Handschuhe). Die Sicherheitsdatenblätter (SDB) sind abzurufen unter thermofisher.com/support.
ACHTUNG! POTENZIELLE BIOGEFAHR. Informieren Sie sich auf der jeweiligen Produktwebsite (unter thermofisher.com) über biologische
Gefahren, die von dem Produkt ausgehen können. Tragen Sie eine geeignete Schutzbrille sowie Schutzkleidung und -handschuhe.
Einführung
Das Porzine Parvovirus (PPV) ist ein kleiner Virus mit einsträngiger DNA aus der Familie der Parvoviridae. Der Virus ist ein überall vorkommender
Infektionserreger in Schweinen, der die Fortpflanzung in Schweineherden negativ beeinträchtigt und Züchter weltweit wirtschaftlich betrifft. Das Virus
kann die Plazenta passieren. Die Folgen einer Infektion mit PPV hängen vom Immunstatus des Muttertiers im Trächtigkeitsstadium bei Auftreten der
Infektion ab. Bei nicht-immunen Muttertieren können PPV-Infektionen, die vor dem 35. Tag der Trächtigkeit eintreten, zum Tod des Embryos führen. Nach
etwa 70 Tagen, wenn die Föten immunkompetent sind, kann der Schweinefötus durch die Produktion von Antikörper gegen PPV eine Immunreaktion
starten und die Infektion überleben. Dies führt im Allgemeinen zur Geburt gesunder, serologisch positiver Ferkel.
Der Applied Biosystems™ PrioCHECK™ Porcine Parvovirus Ab Plate Kit weist bereits sieben Tage nach der primären Infektion spezifische Antikörper nach.
Der Antikörpertiter erreicht ungefähr 10 Tagen nach der Infektion ein Plateau.
Durch Titration paarweiser Serumproben, die aus einer Herde in einem Zeitabstand von mehreren Wochen entnommen wurden, kann der Infektionsstatus
überwacht werden. Basierend auf dieser Information können Entscheidungen über die Kontrolle der Infektion durch Impfung getroffen werden.
Testprinzip
Der PrioCHECK™ Porcine Parvovirus Ab Plate Kit ELISA ist ein Test mit Einzelverdünnung. Serumproben werden in einer 1:5 Verdünnung gemessen. Die
Testseren werden mit PPV-Antigen gemischt, während der folgenden Inkubation bilden spezifische Antikörper, falls vorhanden, einen Immunkomplex mit
dem Antigen. Nach dieser Vorinkubation wird die Mischung in eine mit Antikörpern beschichtete Testplatte überführt. Während der anschliessenden
Inkubation in der Testplatte, wird vorhandenes freies PPV-Antigen an die mit Antikörper beschichteten Wells gebunden, wohingegen Antigen, das vorher
einen Immunkomplex mit Antikörpern des Testserums gebildet hat (= blockiertes Antigen) nicht gebunden wird. Nach dem Wegspülen der ungebundenen
Reagenzien gibt man Konjugat zu, welches mit dem gebundenen Antigen reagiert. Nach einer weiteren Inkubation werden die Wells nochmals gewaschen
und Chromogen (TMB) Substrat wird zugegeben. Die Farbentwicklung wird nach 15 Minuten gestoppt und bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.
Komponenten des Testkits
Packung für 176 Proben. Das Kit soll bis zum Verfallsdatum bei 5±3°C auf
bewahrt werden. Siehe Kit-Etikett für jeweiliges Verfallsdatum. Die
Haltbarkeit verdünnter, geöffneter oder rekonstituierter Komponenten ist
nachstehend gegebenenfalls vermerkt.
Komponente
Beschreibung
1: Testplatte
Zwei Streifen-Testplatten.
2: Konjugat (30x)
30x konzentriert, vor dem Gebrauch verdünnen. Ein
Fläschchen enthält 1,5 ml Konjugat. Erst kurz vor
Gebrauch verdünnen, die Konjugatverdünnung nicht
stabil.
3: Verdünnungspuffer (5x)
5x konzentriert, vor dem Gebrauch verdünnen. Ein
Fläschchen enthält 60 ml Verdünnungspuffer.
Haltbarkeit der Verdünnungspuffergebrauchslösung:
5 Stunden bei 22±3°C.
4: Waschpuffer (200x)
200x konzentriert, vor dem Gebrauch verdünnen. Ein
Fläschchen enthält 60 ml Waschpuffer. Haltbarkeit der
Waschlösung: eine Woche bei 22±3°C.
5: Demineralisiertes
Wasser
Ein Fläschchen enthält 10 ml Demineralisiertes
Wasser.
6: Pferdeserum
Lyophilisiert. Ein Fläschchen enthält 3,5 ml lyophilisiertes
Pferdeserum. Haltbarkeit des rekonstituierten
Pferdeserums: bis zum Verfallsdatum bei −20°C.
7: Antigen
Lyophilisiert. Zwei Fläschchen mit je 6,0 ml
lyophilisiertem Antigen. Haltbarkeit des rekonstituierten
Antigens: in Portionen bis zum Verfallsdatum bei −20°C.
8: Referenzserum 1
Gebrauchsfertig. Ein Fläschchen enthält 1,0 ml
Referenzserum 1 (Positivkontrolle).
9: Referenzserum 2
Gebrauchsfertig. Ein Fläschchen enthält 1,0 ml
Referenzserum 2 (Negativkontrolle).
10: Chromogen (TMB)
Substrat
Gebrauchsfertig. Ein Fläschchen enthält 60 ml
Chromogen (TMB) Substrat.
11: Stopplösung
Gebrauchsfertig. Ein Fläschchen enthält 60 ml
Stopplösung.
Weitere Kitbestandteile
•Gebrauchsinformation
•1 Deckel um die Streifen während der
Inkubation abzudecken
Zusätzlich benötigte Materialien und Geräte
Sofern nichts Gegenteiliges angegeben wurde, können alle Materialien auf
thermofisher.com bezogen werden.
Beschreibung
Laborausrüstung gemäss den nationalen Sicherheitsvorschriften.
Blindplatten für die Verdünnung der Testseren und zum
vorinkubieren mit dem Antigen, z.Bsp.: U-Bodenplatten
(Kat.-Nr. 267245). Es können auch andere Platten oder Röhrchen
mit geringer unspezifischer Proteinadsorption verwendet werden.
Microtiterplatten-Inkubator mit Temperaturregelung (mindestens 50°C)
Analysen-
Plattenleser. Der Leser muss einen geeigneten Filtersatz haben um
die Platten bei 450 nm ablesen zu können.
Waschgerät.
Ablauf des Tests
Vorsichtsmassnahmen
•Nationale Sicherheitsvorschriften müssen streng befolgt werden.
•Der PrioCHECK™ Porcine Parvovirus Ab Plate Kit muss in für diesen
Zweck geeigneten Laboratorien durchgeführt werden.
•Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet werden und alle mit
den Proben in Berührung kommenden Gegenstände als potentiell
kontaminiert erachtet werden.
Hinweise
Um optimale Ergebnisse mit dem PrioCHECK™ Porcine Parvovirus Ab
Plate Kit zu erhalten, müssen folgende Hinweise beachtet werden:
•Das Testverfahren muss streng eingehalten werden.
•Alle Reagenzien des Kits müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur
(22±3°C) gebracht werden.
•Pipettenspitzen müssen nach jedem Pipettierschritt gewechselt werden.
•Für jedes Reagenz müssen eigene Behälter verwendet werden.
•Kitbestandteile dürfen nach ihrem Verfallsdatum, oder wenn Änderungen
in ihrem Aussehen festgestellt werden, nicht mehr verwendet werden.
•Kitbestandteile verschiedener Kit-Chargennummern dürfen nicht
zusammen verwendet werden.
•Demineralisiertes Wasser oder Gleichwertiges für den Test verwenden.
Vorbereitung der Lösungen
Verdünnungspuffergebrauchslösung
Den konzentrierten Verdünnungspuffer (5) (Komponente 3) in deminera-
lisiertem Wasser 1:5 verdünnen.
Stabilität der Verdünnungspuffergebrauchslösung: 5 Stunden bei 22±3°C.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
18 März 2019
Pferdeserum
Rekonstituieren des lyophilisierten Pferdeserums (Komponente 6) in 3,5 ml
Demineralisiertem Wasser (Komponente 5). Das rekonstituierte
Pferdeserum kann bis zum Verfallsdatum bei −20°C aufbewahrt werden.
Rekonstitution der lyophilisierten Reagenzien:
1. Die Fläschchen auf 22±3°C bringen.
2. Fläschchen aufrecht halten und leicht gegen die Arbeitsfläche schlagen
um sicherzustellen, dass sich der Inhalt auf dem Boden des Fläschchens
befindet.
3. Fläschchen öffnen.
4. Angegebene Menge an Demineralisiertem Wasser zufügen.
5. Warten bis sich lyophilisiertes Material aufgelöst hat.
6. Stöpsel wieder auf das Fläschchen setzen und das Fläschchen
vorsichtig schwenken, damit sich restliches trockenes Material auflöst.
7. Lyophilisiertes Material 15 Minuten bei 22±3°C stehen lassen.
8. Gelegentlich Fläschchen behutsam umdrehen (Schaumbildung muss
vermieden werden).
Konjugatpuffer
Um den Test mit zwei Streifen durchzuführen 1,9 ml Verdünnungspuffer-
gebrauchslösung zu 0,1 ml rekonstituiertem Pferdeserum
(Endkonzentration des Pferdeserums beträgt 5% (v/v)) zugeben.
Stabilität des Konjugatpuffers: 24 Stunden bei 5±3°C.
Konjugatvedünnung
Verdünnen des Konjugats (30x) (Komponente 2) 1:30 in Konjugatpuffer.
Um den Test mit zwei Streifen durchzuführen 1,8 ml zubereiten.
Hinweis: Die Konjugatverdünnung ist nicht stabil, erst kurz vor
Verwendung anfertigen.
Antigen
Rekonstituieren des Antigens (Komponente 7) mit 6 ml Verdünnungs-
puffergebrauchslösung. Wird nur ein Teil des Testkits verwendet, muss das
Fläschchen mit rekonstituiertem Antigen in Portionen von je 1,0 ml
eingeteilt werden (für maximal 6 Testläufe pro Platte). Häufiges Einfrieren
und Auftauen vermeiden und das portionierte Antigen in kleinen
Fläschchen bei −20°C lagern.
Waschlösung
Der Waschpuffer (200x) (Komponente 4) muss 1:200 mit demineralisiertem
Wasser verdünnt werden und reicht für ein Gesamtvolumen von 12 Liter aus.
Stabilität der Waschlösung: 1 Woche bei 22±3°C.
Hinweis: Es können kommerzielle ELISA-Waschgeräte verwendet werden.
Falls diese nicht zur Verfügung stehen können die Platten manuell durch
pipettieren von 200 µl bis 300 µl Waschlösung in jedes Well der Platte
gewaschen werden. Danach die Platte ausleeren und den Vorgang so oft
wie vorgeschrieben wiederholen. Es besteht keine Notwendigkeit die Platte
einzuweichen. Die Platten nach dem letzten Waschen fest ausklopfen.
Vorinkubation der Proben und Antigen
1. 96 µl Verdünnungspuffergebrauchslösung mit 24 µl Referenzserum 1
(Komponente 8) und 120 µl rekonstituiertem Antigen mischen.
2. 96 µl Verdünnungspuffer mit 24 µl Referenzserum 2 (Komponente 9)
und 120 µl rekonstituiertem Antigen mischen.
3. 12 µl jeder Serumprobe mit 48 µl Verdünnungspuffergebrauchslösung
und 60 µl rekonstituiertem Antigen mischen.
4. Während 60±5 Minuten bei 37±1°C inkubieren.
Inkubation in der Testplatte
1. Jeden Streifen der Testplatte (Komponente 1) mit einem Markierstift
beschriften.
2. 100 µl der Verdünnungspuffergebrauchslösung in die Wells A1 und B1
pipettieren.
3. 50 µl der Verdünnungspuffergebrauchslösung in die Wells C1 und D1
pipettieren.
4. 50 µl des rekonstituierten Antigens in die Wells C1 und D1 pipettieren
und mischen.
5. 100 µl des Referenzserum 1/Antigen Gemisches in die Wells E1 und F1
pipettieren.
6. 100 µl des Referenzserum 2/Antigen Gemisches in die Wells G1 und
H1 pipettieren.
7. 100 µl des Probe/Antigen Gemisches in die verbleibenden Wells
pipettieren.
8. Die Testplatte abdecken und während 120±5 Minuten bei 37±1°C
inkubieren.
Inkubation mit Konjugat
1. Die Platte entleeren und 6-mal mit 200 µl bis 300 µl Waschlösung
waschen. Die Platte nach dem letzten Waschzyklus fest ausklopfen.
2. 100 µl der Konjugattverdünnung in jedes Well pipettieren.
3. Die Testplatte abdecken und während 60±5 Minuten bei 37±1°C
inkubieren.
Inkubation mit Chromogen (TMB) Substrat
1. Die Testplatte nach der Inkubationszeit entleeren und 6-mal mit
200 µl bis 300 µl Waschlösung waschen. Die Testplatte nach dem letzten
Waschzyklus fest ausklopfen.
2. 100 µl Chromogen (TMB) Substrat in jedes Well pipettieren.
3. Die Testplatte 15 Minuten bei 22±3°C inkubieren.
4. 100 µl der Stopplösung (Komponente 11) in jedes Well zugeben.
5. Inhalte der einzelnen Wells vor dem Messen mischen.
Hinweis: Mit der Zugabe der Stopplösung 15 Minuten nach dem Befüllen
des ersten Wells mit Chromogen (TMB) Substrat beginnen. Die
Stopplösung in derselben Reihenfolge und Geschwindigkeit zugeben wie
das Chromogen (TMB) Substrat.
Ablesen des Tests und Berechnung der Ergebnisse
1. Die optische Dichte (OD) der Wells bei 450 nm innerhalb von
15 Minuten nach Stoppen der Farbentwicklung messen.
2. Den mittleren OD450-Wert der Wells A1 und B1 (= OD450 Blindwert)
berechnen.
3. Den korrigierten OD450-Wert der Referenzseren 1 und 2 und der Serum-
proben durch Subtrahieren des mittleren OD450-Blindwerts berechnen.
4. Den Mittelwert der korrigierten OD450 der Wells C1 und D1
(= OD450 max) berechnen.
5. Die prozentuale Inhibition (PI) wird gemäss nachstehender Formel
berechnet:
Hinweis: Die korrigierte OD450 aller Proben wird als prozentuale Inhibition
(PI) im Verhältnis zur korrigierten mittleren OD450 max ausgedrückt.
PI = 100 − (korrigierte OD450 Testprobe / korrigierte OD450 max) × 100
Auswertung der Ergebnisse
Validitätskriterien
1. Die mittlere OD450 der Blindkontrolle (Wells A1 und B1) muss <0,300 sein.
2. Die korrigierte OD450 max (Wells C1 und D1) muss >1,000 sein.
3. Die PI von Referenzserum 1 (Positivkontrolle) muss >50% sein.
4. Die PI von Referenzserum 2 (Negativkontrolle) muss <50% sein.
Wird eines der Kriterien nicht erfüllt so ist die Platte ungültig.
Hinweis: Wenn die korrigierte OD450 max unter 1,000 liegt, ist das
Chromogen (TMB) Substrat vermutlich zu kalt. In diesem Fall die Lösung
vorher auf 22±3°C erwärmen oder bis zu 30 Minuten inkubieren.
Wenn die korrigierte mittlere OD450 max über 2,000 liegt wird eine kürzere
Inkubationszeit mit dem Chromogen (TMB) Substrat empfohlen.
Auswertung der prozentualen Inhibition
PI = ≥50%
Probe ist positiv auf PPV-spezifische Antikörper.
PI = <50%
Probe ist negativ auf PPV-spezifische Antikörper.
Referenzen
Westenbrink F, Veldhuis MA, Brinkhof JA (1989). Journal of Virological
Methods 23:169-178.
Kundendienst und technischer Support
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• Telefonnummern von Ansprechpartnern weltweit
• Bestellungs- und Web-Support
• Betriebsanweisungen, Handbücher und Protokolle
• Analysezertifikate
• Sicherheitsdatenblätter (SDB)
HINWEIS: Wenden Sie sich für Sicherheitsdatenblätter für Reagenzien
und Chemikalien anderer Hersteller an den jeweiligen Hersteller.
Beschränkte Gewährleistung
Die Life Technologies Corporation bzw. ihre verbundenen Unternehmen
räumt dem Käufer für ihre Produkte Gewährleistungsrechte wie in den
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die auf der Website von Life Technologies unter thermofisher.com/
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Sollten Sie Fragen haben, kontaktieren Sie bitte Life Technologies unter
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Versionsgeschichte: Pub. Nr. MAN0013811 (Deutsch)
Ver.
Datum
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A.0 18 März 2019
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