Thermo Fisher Scientific PrioCHECK PRV gB serum pig 7589100 Benutzerhandbuch

Marke: Thermo Fisher Scientific

Modell: PrioCHECK PRV gB serum pig 7589100

Typ: Benutzerhandbuch

PrioCHECK® PRV gB

ELISA für in vitro Nachweis von Antikörpern gegen das Glykoprotein B (gB) des Pseudorabies Virus (PRV)

im Schweineserum

Packung mit 5 Platten für 450 Proben

©Prionics AG

Version 1.5_d

Nur für in-vitro Veterinärdiagnostik

Bei 5±3°C lagern

Produkt-Nr.: 7589100

Für Deutschland: Zul.Nr: BGVV-B 352

Einführung

Pseudorabies, auch Aujeszkysche Krankheit genannt,

wird durch das Pseudorabies Virus (PRV), ein alpha

Herpesvirus verursacht. Pseudorabies ist eine weit

verbreitete Infektion von Schweinen mit grosser

ökonomischer Bedeutung für die Schweineindustrie.

Das Virus kann eine Vielzahl klinischer Symptome

verursachen, unter anderen Erkrankungen des Ner-

vensystems, der Atemwege, des Reproduktionsappe-

rates und kann tödlich verlaufen. Der PrioCHECK®

PRV gB weist Antikörper, die gegen das Glykoprotein

B (gB) von PRV gerichtet sind im Serum infizierter

Schweine nach. Das Glykoprotein B (=gII: alte No-

menklatur) ist ein wichtiger Bestandteil der Hülle von

PRV. Das Glykoprotein B ist für die Infektion unent-

behrlich. Der PrioCHECK® PRV gB ist äußerst nütz-

lich, um Schweine zu identifizieren, die mit verschie-

denen Arten des Feldvirus infiziert sind oder Schwei-

ne, die geimpft wurden (1,2).

Der PrioCHECK® PRV gB zum Nachweis von Antikör-

pern gegen das Pseudorabies Virus (PRV) in Schwei-

neserum kann verwendet werden :

- um den PRV-freien Status von Schweineherden

zu überwachen.

- für den Nachweis von PRV Antikörpern nach

Impfung.

- um die PRV-Antikörpertiter im Schwein nach der

Impfung zu überprüfen.

- für Einzeltier und Herden Untersuchungen.

Testprinzip

Der PrioCHECK® PRV gB ist ein Blocking-ELISA und

weist Antikörper (Ak) gegen das Pseudorabies Virus

nach. Die Reaktion zwischen einem Epitop, lokalisiert

auf dem Glykoprotein B (gB) von PRV und einem

spezifischen monoklonalen Antikörper (mAk) wird

durch PRV-gB spezifische Antikörper in der Probe

verhindert.

Eine Mikrotiterplatte wird mit nicht-infektiösem PRV

Antigen beschichtet. Unverdünntes Schweineserum

wird in die Wells der Platte gegeben und für eine

Stunde bei 37±1°C oder bei Raumtemperatur

(22±3°C) inkubiert. Nach dem Waschen der Platte wird

das mAk-HRP Konjugat zugegeben und die Platte wird

wiederum für eine Stunde bei 37±1°C oder 22±3°C

inkubiert. Die Platte wird gewaschen und Chromogen

(TMB) Substrat zugegeben. Nach 20 Minuten wird die

Farbentwicklung durch Zugabe von Stopplösung

gestoppt und die optische Dichte (OD) bei 450 nm

gemessen.

Komponenten des Testkits

Der Testkit wird bis zum Verfallsdatum bei 5±3°C

gelagert. Siehe Kit-Etikett für jeweiliges Verfallsdatum.

Die Haltbarkeit verdünnter, geöffneter oder rekonstitu-

ierten Komponenten ist nachstehend gegebenenfalls

vermerkt. Chemische Gefahrstoffdaten sind im Ab-

schnitt „Sicherheitsvorschriften und R&S Angaben“

(Anhang II) aufgeführt.

Komponente 1

Testplatte

Fünf Streifen-Testplatten werden in vakuumierten

Beuteln, die ein Trocknungsmittel enthalten, geliefert.

Komponente 2

Konjugat (30x)

(30x konzentriert, vor dem Gebrauch verdünnen)

Ein Fläschchen enthält 2,5 ml Konjugat.

Konjugat erst kurz vor Gebrauch verdünnen

Komponente 3

Verdünnungspuffer (gebrauchsfertig)

Ein Fläschchen enthält 60 ml Verdünnungspuffer.

Komponente 4

Waschpuffer (200x)

(200x konzentriert, vor dem Gebrauch verdünnen). Ein

Fläschchen enthält 60 ml Waschpuffer.

Haltbarkeit der Waschlösung: 1 Woche bei 22±3°C.

Komponente 5

Demineralisiertes Wasser

Ein Fläschchen enthält 10 ml demineralisiertes Was-

ser.

Komponente 6

Pferdeserum (lyophilisiert)

Ein Fläschchen enthält 6,0 ml lyophilisiertes Pferdese-

rum.

Das rekonstituierte Pferdeserum kann bis zum Ver-

fallsdatum bei -20°C aufbewahrt werden.

Komponente 7

Positivkontrolle (gebrauchsfertig)

Ein Fläschchen enthält 2,5 ml Positivkontrolle.

Komponente 8

Validierungskontrolle (gebrauchsfertig)

Ein Fläschchen enthält 2,5 ml Validierungskontrolle.

Komponente 9

Negativkontrolle (gebrauchsfertig)

Ein Fläschchen enthält 2,5 ml Negativkontrolle.

Komponente 10

Chromogen (TMB) Substrat (gebrauchsfertig)

Ein Fläschchen enthält 60 ml Chromogen (TMB)

Substrat.

Komponente 11

Stopplösung (gebrauchsfertig)

Ein Fläschchen enthält 60 ml Stopplösung.

Weitere Kitbestandteile:

- Gebrauchsinformation

- 10 Abdeckfolien

- Analysenzertifikat

Zusätzlich benötigte Materialien und

Geräte

Allgemein:

Laborausrüstung gemäss den nationalen Sicherheits-

vorschriften.

Inkubationsschritte:

Mikrotiterplatten Inkubator (aufheizbar auf mindestens

50°C).

Analysenergebnisse:

Platten-Photometer z.B Multiscan EX oder gleichwer-

tig.

Das Photometer muss einen geeigneten Filtersatz

haben um die Platten bei 450 nm lesen zu können.

Optional:

Plattenwascher, z.B. Tecan EIA Plattform oder

gleichwertig.

Ablauf des Tests

Vorsichtsmassnahmen

Beim Arbeiten mit Tierproben müssen die nationalen

Richtlinien streng befolgt werden. Der PrioCHECK®

PRV gB muss in für diesen Zweck geeigneten Labora-

torien durchgeführt werden.

Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet

werden und alle mit den Proben in Berührung kom-

menden Gegenstände als potentiell kontaminiert

erachtet werden.

Chemische Gefahrstoffdaten sind in Abschnitt „Sicher-

heitsvorschriften und R&S Angaben“ (Anhang II)

aufgeführt.

Hinweise

Um optimale Ergebnisse mit dem PrioCHECK® PRV

gB zu erhalten, müssen folgende Hinweise beachtet

werden:

 Das Testverfahren muss streng eingehalten

werden.

 Alle Reagenzien des Kits müssen vor Gebrauch auf

Raumtemperatur (22±3°C) gebracht werden.

 Pipettenspitzen müssen nach jedem Pipettierschritt

gewechselt werden.

 Für jedes Reagenz muss ein eigenes Reagenzre-

servoir verwendet werden.

 Kitbestandteile dürfen nach ihrem Verfallsdatum,

oder wenn Änderungen in ihrem Aussehen festge-

stellt werden, nicht mehr verwendet werden.

 Kitbestandteile verschiedener Kit-Chargennummern

dürfen nicht zusammen verwendet werden.

 Demineralisiertes Wasser oder gleichwertiges für

den Test verwenden

VORBEREITUNG DER LÖSUNGEN

Pferdeserum

Das lyophilisierte Pferdeserum (Komponente 6) wird

mit 6 ml demineralisiertem Wasser (Komponente 5)

rekonstituiert

. Das rekonstituierte Pferdeserum kann

bis zum Verfallsdatum bei -20°C gelagert werden.

ELISA-Puffer

1 Volumenteil des rekonstituierten Pferdeserums mit 9

Volumenteilen Verdünnungspuffer (Komponente 3)

mischen (Endkonzentration des Pferdeserums im

Puffer beträgt 10 %).

Für jeden Analyseansatz muss frisch zubereiteter

ELISA-Puffer verwendet werden. Deshalb nur die für

den Analyseansatz benötigte Menge an ELISA-Puffer

zubereiten (11 ml pro Testplatte zubereiten).

Konjugat Verdünnung

Das Konjugat (30x) (Komponente 2) wird 1:30 mit

ELISA-Puffer verdünnt. (11 ml für jede Testplatte)

Hinweis: Das Konjugat (30x) erst kurz vor Ge-

brauch verdünnen.

Das Rekonstituieren der lyophilisierten Reagenzien muss wie folgt

durchgeführt werden:

- Das Fläschchen auf Raumtemperatur (22±3°C) erwärmen.

- Das Fläschchen in aufrechter Stellung leicht gegen die Arbeitsfläche

schlagen um sicherzustellen, dass sich der Inhalt auf dem Boden des

Fläschchens befindet.

- Fläschchen öffnen.

- Angegebene Menge an demineralisiertem Wasser zugeben.

- Stöpsel wieder auf das Fläschchen setzen und das Fläschchen

vorsichtig schwenken, damit sich das gesamte Lyophilisat auflöst.

- Das Fläschchen 15 Minuten bei 22±3°C stehen lassen.

Gebrauchsinformation

Die deutsche Gebrauchsinformation ist

nach § 17c TierSG zugelassen

PrioCHECK® PRV gB

Waschlösung

Der Waschpuffer (200x) (Komponente 4) muss 1:200

mit demineralisiertem Wasser verdünnt werden und

reicht für ein Gesamtvolumen von 12 Liter aus.

Stabilität der Waschlösung: 1 Woche bei 22±3°C.

Hinweis: Es können kommerzielle ELISA-Washer

verwendet werden. Falls diese nicht zur Verfügung

stehen, kann die Platte durch Zugeben von 200 bis

300 µl Waschpuffer in die Wells der Platte gewaschen

werden. Danach die Platten ausleeren und den Vor-

gang so oft wie vorgeschrieben wiederholen. Die

Platte muss zwischen den Waschschritten nicht

inkubiert werden. Die Platte nach dem letzten Wa-

schen fest ausklopfen.

INKUBATION DES SERUMS

1.1 100 µl der Positivkontrolle (Komponente 7) in die

Wells A1 und B1 geben.

1.2 100 µl der Validierungskontrolle (Komponente 8)

in die Wells C1 und D1 geben.

1.3 100 µl der negativkontrolle (Komponente 9) in

die Wells E1 und F1 geben.

1.4 100 µl der zu analysierenden Proben in die

restlichen Wells geben.

1.5 Die Testplatte abdecken und leicht schütteln.

1.6 Die Testplatte für 60±5 Minute bei 37±1°C (oder

bei 22±3°C) inkubieren.

INKUBATION MIT KONJUGAT

2.1 Die Testplatte nach der Inkubationszeit auslee-

ren und 6-mal mit 200 bis 300 µl Waschlösung

waschen. Die Testplatte nach dem letzten Wa-

schen fest ausklopfen.

2.2 100 µl des verdünnten Konjugats in die Wells

der Testplatte geben.

2.3 Die Testplatte abdecken und leicht schütteln.

2.4 Die Testplatte für 60±5 Minute bei 37±1°C

(oder bei 22±3°C) inkubieren.

INKUBATION MIT CHROMOGEN (TMB) SUBSTRAT

3.1 Die Testplatte nach der Inkubationszeit auslee-

ren und 6-mal mit 200 bis 300 µl Waschlösung

waschen. Die Testplatte nach dem letzten Wa-

schen fest ausklopfen.

3.2 100 µl Chromogen (TMB) Substrat (Komponente

10) in alle Wells zugeben.

3.3 Die Testplatte 20 Minuten bei 22±3°C inkubie-

ren.

3.4 100 µl Stopplösung (Komponente 11) in alle

Wells zugeben.

3.5 Die Testplatte leicht schwenken.

Hinweis: Mit der Zugabe der Stopplösung 20 Minuten

nach dem Befüllen des ersten Wells mit Chromogen

(TMB) Substrat beginnen. Die Stopplösung in der

gleichen Reihenfolge und mit der gleichen Geschwin-

digkeit wie das Chromogen (TMB) Substrat zugeben.

LESEN DES TESTS UND BERECHNUNG DER

ERGEBNISSE

4.1 Messung der optischen Dichte (OD) der Wells

bei 450 nm, innerhalb von 15 Minuten, nach

stoppen der Farbentwicklung.

4.2 Den Mittelwert der Wells E1 - F1 (=OD450 maxi-

mum) berechnen.

4.3 Die prozentuale Inhibition (PI) der Kontrollen und

der Proben wird gemäss nachstehender Formel

berechnet.

Hinweis: Die OD450-Werte aller Proben werden als

prozentuale Inhibition (PI) im Verhältnis zum

OD450Maximum dargestellt.

OD450 Probe

PI = 100 - ---------------------------------------- x 100

OD450 max

AUSWERTUNG DES ERGEBNIS

Validitätskriterien

5.1 Die mittlere OD450 max der Negativkontrolle

muss mindestens 1,000 sein.

5.2 Die mittlere prozentuale Inhibition der Positiv-

kontrolle muss > 50% sein.

5.3 Die mittlere prozentuale Inhibition der Validie-

rungskontrolle muss < 50% sein.

5.4 Wird eines der Kriterien nicht erfüllt, so ist die

Testplatte ungültig.

Hinweis: Wenn die mittlere OD450max unter 1,000

liegt, kann es sein, dass das Chromogen (TMB)

Substrat zu kalt ist. In diesem Fall die Lösung auf

22±3°C erwärmen oder das Substrat bis zu 30 Minu-

ten inkubieren.

Auswertung der prozentualen Inhibition

PI = 50% (Positiv)

Es liegen PRV gB spezifische Antikörper in der Probe

vor.

PI = <50% (Negativ)

Es liegen keine PRV-gB spezifische Antikörper in der

Probe vor.

Anhang I

Hinweis

Diese Gebrauchsinformation gilt als vollständig und richtig

zum Zeitpunkt ihrer Veröffentlichung. Inhalte der Ge-

brauchsinformation bedürfen in Deutschland der Geneh-

migung durch das Friedrich-Loeffler Institut (FLI). Die

Prionics AG haftet keinesfalls für Neben- oder Folgeschä-

den, die sich im Zusammenhang mit oder in der Folge der

Benutzung dieser Gebrauchsinformation ergeben.

Haftbarkeit

Die Prionics AG garantiert, dass ihre Produkte die ent-

sprechende veröffentlichte Spezifikation erfüllen, wenn sie

in Übereinstimmung mit den entsprechenden Anleitungen

und innerhalb der angegebenen Produktlebensdauer

verwendet werden. Die Prionics AG gibt keine andere

Garantie, weder ausdrücklich noch stillschweigend. Das

Unternehmen übernimmt keinerlei Garantie hinsichtlich der

Marktgängigkeit und Eignung seiner Waren für einen

besonderen Zweck. Die hier erteilte Garantie und die

Daten, Spezifikationen und Beschreibungen der Produkte

der Prionics AG, die in den von der Prionics AG herausge-

gebenen Katalogen auftauchen und die Informationen zum

Produkt können nicht verändert werden, ausser durch

ausdrückliche schriftliche Zustimmung durch ein Vor-

standsmitglied der Prionics AG. Mündliche oder schriftliche

Informationen, die nicht mit dieser Garantie übereinstim-

men, oder falls sie weitergegeben werden, sind nicht

genehmigt, und falls sie gegeben werden, sind sie nicht

gültig.

Bei Auftreten eines Defektes, der im Rahmen der vorste-

henden Garantiebestimmungen gedeckt ist, besteht für die

Prionics AG nur die Verpflichtung, wahlweise das entspre-

chende Produkt oder Teile hiervon zu reparieren oder zu

ersetzen, wobei es im Ermessen von der Prionics AG liegt,

ob das Produkt ersetzt oder repariert wird. Dem Kunden

obliegt es, die Prionics AG rechtzeitig über das Auftreten

eines solchen Defektes zu informieren. Wenn die Prionics

AG das Produkt oder einen Teil davon nicht innerhalb

einer angemessenen Frist reparieren oder ersetzen kann,

wird die Prionics AG den Kaufpreis für das Produkt oder

dessen Teil zurückerstatten.

Soweit im Rahmen des anwendbaren Rechts zulässig, ist

die Prionics AG nicht ersatzpflichtig für direkte, indirekte,

spezifische oder Folgeschäden von finanziellen Verlusten

oder Beschädigungen infolge der Verwendung ihrer

Produkte.

Prionics AG und Prionics Lelystad BV sind nach ISO

9001:2000 zertifizierte Gesellschaften.

Anhang II

Sicherheitsvorschriften und R&S Sätze

Nationale Sicherheitsvorschriften müssen strickt eingehal-

ten werden.

R&S Sätze

Komponente 1

Testplatte