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25. September 2019
VorbereItung der Lösungen
Konjugatverdünnung
Konjugats (30x) (Komponente 2) 1:30 in Konjugat Verdünnungspuffer
(Komponente 3) verdünnen; für z.B 1 Platte wird eine Menge von 12 ml
benötigt. Hierzu werden 0,4 ml Konjugat (30x) in 11,6 ml Konjugat
Verdünnungspuffer verdünnt.
Hinweis: Die Gebrauchslösung darf erst kurz vor ihrer Verwendung
hergestellt werden.
Waschlösung
Der Waschpuffer (200x) (Komponente 4) muss mit demineralisiertem
Wasser 1:200 verdünnt werden. Eine Flasche reicht für ein Endvolumen
von 12 Liter.
Stabilität der Waschlösung: 1 Woche bei 22±3°C.
Zu beachten: Ungenügendes Waschen der Testplatte kann zu hohen
Hintergrundsignalen führen. Die Verwendung eines automatischen
Plattenwaschers ist dem Waschen mit Multikanalpipetten vorzuziehen.
Eine Einwirkzeit zwischen den Waschschritten ist nicht nötig. Ein
minimales Volumen von 200 µl pro Vertiefung ist ausreichend für ein
angemessenes Waschen der Platte.
Inkubation des Serums
1. 20 µl der Proben Verdünnungspuffers (Komponente 5) in der Platte
vorlegen.
2. 80 µl der Negativkontrolle (Komponente 8) in die Vertiefungen
A1 und B1 zugeben.
3. 80 µl der Schwachpositivkontrolle (Komponente 7) in die Vertiefungen
C1 und D1 zugeben.
4. 80 µl der Positivkontrolle (Komponente 6) in die Vertiefungen
E1 und F1 zugeben.
5. 80 µl der Proben in je eine (Einzelbestimmung) oder zwei
(Doppelbestimmung) benachbarte Vertiefungen der Testplatte
zugeben.
6. Testplatte mit Abdeckfolie schliessen.
7. Die Testplatte vorsichtig schütteln.
8. Die Testplatte für 60±5 Minuten bei 37±1°C inkubieren.
Inkubation mit dem Konjugat
1. Die Testplatte entleeren und 6 mal mit 200 bis 300 µl Waschlösung
waschen. Die Platte nach dem letzten Waschzyklus fest ausklopfen.
2. 100 µl der Konjugatverdünnung in alle Vertiefungen geben.
3. Testplatte mit Abdeckfolie schliessen.
4. Die Testplatte für 30±1 Minuten bei 37±1°C inkubieren.
Inkubation mit Chromogen (TMB) Substrat
1. Die Testplatte entleeren und die Platte 6-mal mit 200 bis 300 µl
Waschlösung waschen. Die Platte nach dem letzten Waschzyklus fest
ausklopfen.
2. 100 µl des Chromogen (TMB) Substrats (Komponente 9) in alle
Vertiefungen geben.
3. Inkubation der Testplatte für 20 Minuten bei 22±3°C.
4. 100 µl der Stopplösung (Komponente 10) zu allen Vertiefungen geben.
5. Testplatte vor der Messung vorsichtig schütteln.
Hinweis: Beginnen Sie mit der Zugabe der Stopplösung 20 Minuten nach
dem Befüllen der ersten Vertiefung mit Chromogen (TMB) Substrat.
Stopplösung in derselben Reihenfolge und mit der gleichen
Geschwindigkeit wie das Chromogen (TMB) Substrat zugeben.
Messen der testplatte und berechnung der ergebnisse
1. Die optische Dichte (OD) der Vertiefungen bei 450 nm wird innerhalb
von 15 Minuten nach Zugabe der Stopplösung gemessen.
2. Berechnung des mittleren OD450–Wertes der Negativkontrolle (Well A1
und B1). Das entspricht dem OD450 max Wert.
3. Berechnung der prozentualen Inhibition (PI) der Schwachpositiv-
kontrolle und Positivkontrolle der Proben gemäss der nachstehenden
Formel.
Der OD450 aller Proben wird als prozentuale Inhibition (PI) im Verhältnis
zum mittleren OD450 max der Negativkontrolle (well A2 und B1)
ausgedrückt.
PI = 100 − (OD450 Probe / OD450 max) × 100
Auswertung der Ergebnisse
Validitätskriterien
1. Der mittlere OD450–Wert der Negativkontrolle (Vertiefung A2 und B1)
muss >1,000 OD sein.
2. Die prozentuale Inhibition der Schwachpositivkontrolle muss
>50% sein.
3. Die prozentuale Inhibition der Positivkontrolle muss >80% sein.
Werden diese Kriterien nicht erfüllt, sind die Resultate ungültig und der
Test muss wiederholt werden.
Hinweis:
• Ist die OD450 einer Probe höher ist als die OD450 max, so kann dies als
0% Inhibition gewertet werden.
• Wenn der Mittelwert der Negativkontrolle unter 1,00 liegt, wurde das
Chromogen (TMB) Substrat vermutlich nicht bis auf Raumtemperatur
erwärmt. Erwärmen Sie in diesem Fall die Lösung vorher auf 22±3°C
oder inkubieren Sie das Chromogen (TMB) Substrat bis zu 30 Minuten
bevor die Farbreaktion gestoppt wird.
• Wenn der OD450-Mittelwert der Negativkontrolle über 2,00 liegt, wird
eine kürzere Inkubation mit dem Chromogen (TMB) Substrat
empfohlen.
Auswertung der Resultate
PI = <40% Negativ
Es liegen keine CSFV-spezifischen
Antikörper in der Probe vor.
PI = ≥40% Positiv
Es liegen CSFV-spezifischen
Antikörper in der Probe vor.
Referenzen
1. Holm Jensen M (1981). Acta Vet Scand 22:85–98.
2. Wensvoort G, Bloemraad M, Terpstra C (1988). Vet Microb 17:129–140.
3. Wensvoort G (1989). J Gen Virol 70:2865−2876.
4. Wensvoort G, Boonstra J, Bodzinga BG (1990). J Gen Virol 71:531–540.
5. Colijn E, Bloemraad M, Wensvoort G (1997). Vet Microbiol 59:15–25.
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B.0 25. September 2019
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• Die Beschreibung für Revision A.0 in dieser Tabelle wurde
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Ab 2.0 in PrioCHECK™ Porcine CSFV Ab 2.0 Strip Kit
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