Thermo Fisher Scientific LSIVet™ Ruminant Paratuberculosis Advanced Benutzerhandbuch

Marke: Thermo Fisher Scientific

Modell: LSIVet™ Ruminant Paratuberculosis Advanced

Typ: Benutzerhandbuch

5791 Van Allen Way | Carlsbad, CA 92008 USA

Phone +1 760 603 7200 | Toll Free in USA 800 955 6288 Für tierärztlichen Gebrauch. Ausschließlich für in vitro zu verwenden.

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20 November 2013

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Berechnungen

Zu berechnen ist die mittlere optische Dichte (ODm) der Positivkontrolle (PK): ODm PK, sowie die mittlere

optische Dichte (ODm) der Negativkontrolle (NK), ODm NK.

Für jede Probe wird der S/P-Quotient (Verhältnis Probe/positiv getestete Probe) berechnet:

S/P% = [(OD Probe – ODm NK) / (ODm PK – ODm NK)] x 100

HINWEIS: Bei negativen Proben kann sich für den S/P-Quotienten ein negativer Wert ergeben.

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Validierung

Der Test gilt als validiert, wenn: ODm NK < 0,400 und ODm PK / ODm NK > 4

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Interpretation der Ergebnisse

RIND

ERGEBNIS INTERPRETATION

S/P% < 60 NEGATIV

S/P% ≥ 60 POSITIV

SCHAF/ZIEGE

ERGEBNIS INTERPRETATION

S/P% < 70 NEGATIV

S/P% ≥ 70 POSITIV

LSIVet™ Ruminant Paratuberculosis Advanced -

Serum

Enzymimmunoassay zum spezifischen Nachweis von Antikörpern gegen

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis im Serum von Rinder, Schafe und Ziegen

Gebrauchsinformation: Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach §17c TierSG

zugelassen.

Produktreferenz DVETPTRS5

Publikationsnummer MAN0007951 Version A.0

Verfahren Tierart Probenmaterial Probenart Protokoll

Indirekte ELISA-Einzeltests –

Streifenplatten

Rinder

Schafe

Ziegen

Serum Einzelproben

Kurze Inkubation

Lange Inkubation

Deutsche amtliche Zulassung nach § 17 c TierSG: FLI-B 605

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Allgemeine Informationen

Die Paratuberkulose (Johne’sche-Krankheit) ist eine durch Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP),

ein grampositives Bakterium, verursachte chronische Enteritis (erste pathologische Veränderungen an

Mesenteriallymphknoten und Dünndarm).

Typische klinische Symptome sind Diarrhö, Gewichtsverlust und Ödeme. Die meisten Tiere zeigen

allerdings erst dann klinische Symptome, wenn die Krankheit wirklich manifest ist.

Die Paratuberkulose ist eine komplexe Krankheit, die durch verschiedene Faktoren beeinflusst wird:

Resistenzverhalten des Erregers, Belastung der Umwelt mit ausgeschiedenen Bakterien, Inkubationszeit,

gelegentlich späte Serokonversion.

Die Kontrolle der Krankheit basiert auf der Identifizierung infizierter Tiere und deren Elimination.

Die wichtigsten Diagnosemethoden sind: mikroskopischer Nachweis der Bakterien, kulturelle Anzüchtung,

ELISA und PCR.

Um bei serologischen Verfahren unspezifische Reaktionen mit anderen Mykobakterien zu vermeiden,

müssen die Proben zuerst mit Mycobacterium phlei inkubiert werden.

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Testprinzip

Das Kit basiert auf dem Prinzip eines indirekten ELISA.

1 – Proben und Kontrollen werden in die mit Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP)-Antigen

beschichteten Wells der Mikrotiterplatte gegeben. Sind anti-MAP-Antikörper vorhanden, so binden diese

an das Antigen und bilden Antigen-Antikörper-Komplexe.

2 – Nach dem Waschen wird anti-Wiederkäuer-HRP-markiertes Konjugat hinzugefügt, das an die an der

Platte anhaftenden Antikörper bindet.

3 – Ungebundenes Konjugat wird herausgewaschen. Danach wird chromogenes Substrat hinzugefügt. Als

Folge der Substratoxidation durch die Peroxidase des Konjugats kommt es zu einer Blaufärbung.

4 – Nach Stoppen der Reaktion ist ein Farbumschlag nach Gelb zu beobachten. Die Ergebnisse werden mit

einem ELISA-Plattenleser abgelesen.

Die Gelbfärbung zeigt positive Proben an. Die Intensität der Gelbfärbung in jedem Well ist

proportional zur Menge der in der Probe vorhandenen spezifischen Antikörper.

 Inhaltsstoffe

2 LSIVet™ Ruminant Paratuberculosis Advanced - Serum Gebrauchsinformation (MAN0007951) LSIVet™ Ruminant Paratuberculosis Advanced - Serum Gebrauchsinformation (MAN0007951) 3

Komponenten Menge Lagerung

Bezeichnung Beschreibung 480 Tests

1 - Mikrotiterplatte MAP MAP-Antigen beschichtete Platte,

12 Streifen mit 8 Vertiefungen 5 Einheiten #

5 ± 3°C

2 - Negativkontrolle MAP Negativkontrolle (NK) für MAP 1,3 ml

3 - Positivkontrolle MAP Positivkontrolle (PK) für MAP 1,3 ml

4 - Konjugat (50/100x) MAP Anti-Wiederkäue

-HRP Konjugat (50 oder

100x), konzentriert (rot) 1,3 ml *

A - Waschlösung (10x) Waschlösung, 10-fach konzentriert 250 ml

B1 - Proben-Verdünner MAP Proben-Verdünnungspuffer MAP (violett),

gebrauchsfertig 60 ml

B2 - Konjugat-Verdünner MAP Konjugat-Verdünnungspuffer MAP,

gebrauchsfertig 60 ml

C - Substratlösung Substratlösung 60 ml

D - Stopplösung Stopplösung 60 ml

Platten-Klebestreifen 10 UT**

#Unbenutzte Streifen können im verschlossenen Beutel mit Trockenmittel (im Lieferumfang des Testkits enthalten)

bei 5 ± 3°C bis zum Verfallsdatum des Kits gelagert werden.

*Die verdünnte Konjugatlösung ist sofort nach der Zubereitung zu verwenden.

**Umgebungstemperatur

 Benötigtes Material, welches nicht im Lieferumfang enthalten ist

Präzisionspipetten, Multikanalpipetten Einweg-Pipettenspitzen

Vorverdünnungsplatte Destilliertes oder deionisiertes Wasser

ELISA-Plattenleser mit 450-nm Filter oder 450- und 620-nm Filte

Einweg-Gefäße

 Informationen zu Proben

Getestet werden können frische, gekühlte (bei +5 ± 3°C für 8 Tage) oder zuvor tiefgefrorene (1 Jahr,

< –16°C) Seren.

Homogenisierte Einzelproben und Kontrollen werden in 12-facher Verdünnung getestet.

 Vorbereitung der Reagenzien

• Die Reagenzien 1 - Mikrotiterplatte MAP, B1 - Proben-Verdünner MAP, B2 - Konjugat - Verdünner MAP,

C - Substratlösung und D - Stopplösung sind gebrauchsfertig.

• Die Reagenzien 2 - Negativkontrolle MAP und 3 - Positivkontrolle MAP werden wie Proben getestet.

• Die Lösung A - Waschlösung (10x) muss mit destilliertem/deionisiertem Wasser im Verhältnis 1:10

verdünnt werden. Beispiel: - Für 1 Streifen: 2 ml der Lösung A - Waschlösung (10x) in 18 ml Wasser

verdünnen; für 1 Platte: 25 ml der Lösung A - Waschlösung (10x) in 225 ml Wasser verdünnen. Nach der

Verdünnung mischen. Die verdünnte Waschlösung kann einen Monat lang bei 5 ± 3°C aufbewahrt werden.

HINWEIS: Aufgrund der hohen Konzentration an Salzen kann die Lösung A - Waschlösung (10x) Kristalle

enthalten. Diese lassen sich durch Schütteln auflösen. Wir empfehlen die Homogenisierung der Lösung vor

ihrer Verdünnung.

• Das Reagenz 4 - Konjugat (50/100x) MAP muss verdünnt werden: 1:50 im Reagenz B2 - Konjugat -

Verdünner MAP für die kurze Inkubation von Seren. 1:100 im Reagenz B2 - Konjugat-Verdünner MAP

für die lange Inkubation von Seren. Nach der Verdünnung mischen. Die verdünnte Konjugatlösung muss

sofort nach ihrer Zubereitung verwendet werden.

 Testdurchführung

HINWEIS: Alle Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur (21 ± 4°C) äquilibrieren lassen. Die

Toleranz für die Inkubationszeiten beträgt ±10%.

1. Vorinkubation von Kontrollen und Proben

Auf einer Vorverdünnungsplatte:

• 10 μl Reagenz 2 - Negativkontrolle MAP in die Wells A1 und B1 geben (zum Beispiel).

• 10 μl Reagenz 3 - Positivkontrolle MAP in die Wells C1 und D1 geben (zum Beispiel).

• Jeweils 10 μl der Probe in die restlichen Wells geben.

• 110 μl des Reagenz B1 - Proben-Verdünner MAP in alle Wells, die Kontrollen und Proben enthalten,

geben.

Platte zum Mischen vorsichtig hin- und her bewegen und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur

(21 ± 4°C) inkubieren.

2. Überführen der Kontrollen und Proben

100 μl jeder vorinkubierten Probe und Kontrolle von der Vorverdünnungsplatte auf die beschichtete

Mikrotiterplatte überführen. Vorsichtig mischen und die Platte mit einem Klebestreifen verschließen.

• Kurze Inkubation: Die Platte bei Raumtemperatur (21 ± 4°C) für 45 Minuten inkubieren.

• Lange Inkubation: Die Platte über Nacht (16-18 Stunden) bei einer Temperatur von 5 ± 3°C inkubieren.

3. Waschschritt

Die Wells leeren und 4-mal waschen, indem man je 300 μl der verdünnten Waschlösung („Vorbereitung

der Reagenzien“) in jedes Well gibt. Alle Flüssigkeit aus den Wells entfernen und die Platte kräftig auf

einem saugfähigen Papier ausklopfen, um alle Flüssigkeitsspuren zu entfernen. Der Waschschritt kann

wahlweise entweder manuell oder automatisch (mit einem Plattenwascher) durchgeführt werden. Die

Platte nicht ganz trocknen lassen.

4. Verteilung des Konjugats

100 μl der verdünnten Konjugatlösung („Vorbereitung der Reagenzien“) in jedes Well geben. Vorsichtig

mischen und die Platte mit einem neuen Klebestreifen verschließen. Die Platte bei Raumtemperatur

(21 ± 4°C) für 30 Minuten inkubieren.

5. Waschschritt

Den oben beschriebenen „Waschschritt“ wiederholen.

6. Reaktion

100 μl der Lösung C - Substratlösung in jedes Well geben. 2 Sekunden lang durch vorsichtiges Hin- und

Herbewegen der Platte mischen. Die Platte bei Raumtemperatur (21 ± 4°C) für 10 Minuten in Dunkelheit

inkubieren. Die Platte nicht abdecken.

100 μl der Lösung D - Stopplösung in jedes Well geben, wobei die gleiche Reihenfolge wie bei der Zugabe

der Lösung C - Substratlösung einzuhalten ist. 2 Sekunden lang durch vorsichtiges Hin- und Herbewegen

der Platte mischen.

7. Ablesen

Die Unterseite der Platte mit einem weichen Tuch abwischen. Platte binnen 30 Minuten nach Stoppen der

Reaktion bei 450 nm oder einer dualen Wellenlänge von 450-620 nm mit dem Plattenleser ablesen.