Thermo Fisher Scientific HLA Typing Trays Bedienungsanleitung
- Typ
- Bedienungsanleitung
HLA-Typisierungsplatten
Gebrauchsanweisung
Für In-vitro-Diagnostik
1 Einführung:
Invitrogen™HLA-Typisierungsplatten werden für die Identifizierung und Definition von histokompatiblen Antigenen hergestellt
und dienen zur HLA-Typisierung.
Beim Mikrolymphozytentoxizitätstest werden Lymphozyten als Targetzellen eingesetzt. Vitale Zellen lassen sich auf einfache
Weise aus peripherem Blut, Lymphknoten, Milz usw. isolieren. Dieses serologische Testverfahren misst den Zelltod durch
Aktivierung eines Complements (Kaninchen) in Gegenwart bestimmter Antigen-Antikörper-Kombinationen. Die Reaktion der
Antikörper-Antigen-Kombination mit dem Complement wird unter Zugabe einer Vitalfärbung wie z. B. Eosin Y oder
Propidiumiodid mit einem Phasenkontrastmikroskop mit 150-facher Vergrößerung gemessen. Tote Zellen (die das vom
spezifischen Antiserum erkannte Antigen enthalten) absorbieren den Farbstoff und verfärben sich entsprechend. Negative Zellen
(die das vom spezifischen Antiserum erkannte Antigen nicht enthalten) bleiben vital und nehmen keinen Farbstoff auf.
Invitrogen™ HLA-Typisierungsplatten werden im Mikrolymphozytentoxizitätstest zur Definition der HLA-Antigene verwendet.
Einsatzbereite monospezifische und multispezifische Antiseren für die HLA-Antigene sind im Lieferumfang enthalten. Positive
und negative Kontrollen sind im Plattenpaket enthalten.
ACHTUNG: MUSS ALS POTENZIELL INFEKTIONSÜBERTRAGENDES MATERIAL GEHANDHABT WERDEN
Plasma und/oder Serum, aus dem dieses Produkt gewonnen wurde, wurde nach FDA-zugelassenen Testmethoden geprüft und als
negativ für HBsAg, HIV-1 und HCV befunden. Keine Testmethode bietet jedoch absolute Gewissheit für die Abwesenheit von
HIV, Hepatitis B Virus oder anderen infektiösen Stoffen. Deshalb sollten diese Produkte als potenziell infektiöse menschliche
Blutproben gehandhabt werden.
2 Kit-Inhalt:
2.1 72-Well-Platten mit 1 μl/Well Antiserum, bestehend aus 0,1 % Natriumazid als Konservierungsstoff und Phenolrot als
pH-Indikator, überschichtet mit 4-5 μl Mineralöl. Bei -55ºC in einem GEFRIERSCHRANK OHNE
ABTAUAUTOMATIK lagern.
2.2 Kaninchen-Complement, 3 ml vial(s). Bei -55ºC in einem GEFRIERSCHRANK OHNE
2.3 Arbeitsblatt / Analysezertifikat
3 Zusätzlich benötigte Materialien, Reagenzien und Geräte:
3.1 Tischzentrifuge
3.2 Lichtmikroskop
3.3 Invertiertes Phasenkontrast- oder invertiertes Fluoreszenzmikroskop
3.4 Pasteurpipetten, 6 und 9 Zoll
3.5 Mikrotiterspritzen 50 μl, 100 μl, 250 μl
3.6 12x75 mm und 17x100 mm Teströhrchen
3.7 Hämacytometer
3.8 Deckglas 2” x 3”
3.9 Magnetische Beads, Invitrogen™ Dynabeads® HLA Cell Prep I (Produktnummer 21902-USA, 21002D-Alle andere) und
Invitrogen™ Dynabeads® HLA Cell Prep II (Produktnummer 21903-USA, 21003-Alle andere)
3.10 5 % Dextran
3.11 Ficoll-Hypaque-Lösung
3.12 RPMI-1640 Medium mit HEPES-Puffer und Pen/Strep-Zusatz
3.13 Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)
3.14 Trypanblau
3.15 Eosin Y-Lösung oder CFDA
3.16 12-37 % Neutral gepuffertes Formalin, pH-Wert 7,0 ±0,2 oder Propidiumiodid in Abdecklösung (Quench-Lösung)
3.17 Gepooltes Humanserum (PHS), Invitrogen™ Produktnummer 34005100
4 Anforderungen an das Probenmaterial:
4.1 Die Lymphozytensuspension wird aus 10 ml Vollblut hergestellt, das in ein heparinisiertes ACD oder Natriumzitrat
enthaltendes Vacutainer-Röhrchen entnommen wurde. Die Zellenkonzentration wird auf 2-3 x 106 Zellen/ml justiert. Die
Lymphozytensuspension muss innerhalb 48 Stunden ab Gewinnung des Vollbluts hergestellt werden, um die optimale
Vitalität des Vollbluts zu gewährleisten. Die Suspension bis zur Verwendung bei Raumtemperatur lagern.
4.2 Eine Vitalität von mehr als 80 % ohne übermäßige Kontaminierung durch nicht-lymphozytische Zellen ist erforderlich,
um die optimale Leistung des Leukozyt-Typisierungsserums zu gewährleisten.
4.3 Granulozytenkontamination oder ein starker Hintergrund von nicht-vitalen Lymphozyten kann eine falsch positive
Reaktion ergeben.
4.4 Thrombozytenkontamination kann eine unvollständige Lysierung der Lymphozyten verursachen und eine falsch negative
Reaktion zur Folge haben.
4.5 Lymphozyten können gemäß folgender Verfahrensweise oder unter Einsatz weiterer Methoden, die im ASHI Laboratory
Procedure Manual beschrieben sind, bearbeitet werden.
5 Herstellung der Lymphozytensuspension:
5.1 10 ml Vollblut in ein heparinisiertes ACD oder Natriumzitrat enthaltendes Vacutainer-Röhrchen übertragen. (EDTA hat
sich als ungeeigneter Gerinnungshemmer erwiesen.) Die Probe bis zur Verwendung bei Raumtemperatur lagern.
5.2 Das Blut 10 Minuten lang bei
700-900 x g zentrifugieren, um den Buffy-Coat zu gewinnen.
5.2.1 Dazu kann auch ein Aggregationsstoff wie z. B. 5 % Dextran wie folgt verwendet werden:
5.2.1.1 2 ml des 5 %-igen Dextran mit 10 ml Vollblut vermischen und die roten Zellen bei 37°C 15 Minuten lang
sedimentieren lassen.
5.3 Unter Verwendung einer Pasteurpipette den Buffy-Coat sorgfältig aufnehmen (ca. 2 ml) und in ein sauberes 17x100 mm
Röhrchen, das 5 ml HBSS enthält, übertragen. Gut vermischen.
5.4 Dann 4 ml der Ficoll-Hypaque (FH) Gradientenlösung (22°C) in ein sauberes 17x100 mm Röhrchen geben. Die Buffy-
Coat-Suspension sorgfältig auf die FH-Gradientenlösung schichten.
5.5 20 Minuten bei 700 x g zentrifugieren. Nach der Zentrifugation zeigen sich die mononuklearen Zellen als schmales Band
an der Schnittstelle zwischen Plasma/Verdünnungsmittel und Gradientenlösung.
5.6 Die Schicht mononuklearer Zellen vollständig aspirieren und in ein 17x100 mm Röhrchen überführen. Mit 4 ml HBSS
verdünnen.
5.7 10 Minuten bei 600 x g zentrifugieren. Überstand abgießen, Zellpellet sorgfältig resuspendieren, 4 ml HBSS zugeben und
10 Minuten bei
600 x g zentrifugieren.
5.8 Überstand und resuspendiertes Zellpellet in 1 ml RPMI-1640 mit 20 % PHS abgießen.
5.9 Die Zellsuspension an einem Hämacytometer untersuchen. Deren Reinheit beurteilen und eine Zellzählung durchführen.
Die Zellenkonzentration auf 2-3 x 106 Zellen/ml justieren.
5.10 Danach den Vitalitätstest wie folgt durchführen.
5.10.1 Einen Tropfen Trypanblau und einen Tropfen Zellsuspension in ein sauberes Röhrchen geben und gut vermischen.
5.10.2 Die Mischung bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren.
5.10.3 Die Zellvitalität an einem Hämacytometer untersuchen. Vitale Zellen weisen intakte Zellmembranen auf und
erscheinen glatt aus; sie können den Farbstoff Trypan Blue aufhalten und sind deswegen farblos. Nicht- vitale Zellen
keine glatte intakte Zellmembranen und deswegen erscheinen sie nicht glatt. Sie sind unfähig, Trypan Blue aufzuhalten
und sind darum blau gefärbt
5.10.4 Die Lymphozytensuspensionen können nun unter Einsatz der Farbstoffausschlussmethode im
Mikrolymphozytotoxizitätstest Klasse I verwendet werden.
6 B- und T-Zellisolierung:
6.1 Nylon-Wolle-Verfahren:
B- und T-Lymphozyten können mittels der Nylon-Wolle-Methode auf leichte Weise aufgetrennt werden. B-Zellen und
Makrophagen haften an Nylon-Wolle, wogegen das bei T-Zellen nicht der Fall ist. Das Verfahren für die B- und T-
Zellenauftrennung ist in der 4. Ausgabe des ASHI Laboratory Manual; Abschnitt 1.A.6 „Nylon Wool Separation of T
and B Lymphocytes“ beschrieben.
6.2 Bead-Verfahren:
6.2.1 Magnetische Beads werden von verschiedenen Herstellern angeboten.
6.2.2 HLA Cell Prep I und HLA Cell Prep II (Invitrogen™) wurden für die Verwendung mit allen Platten der Klasse I und II
geprüft. Zur Verwendung sind die Herstelleranweisungen zu beachten.
6.2.3 Bead-gereinigte B- und T-Zellen werden generell mit CFDA (Carboxyfluoreszein-Diacetat) oder Ethidium-Bromid
vorgefärbt.
7 Mikrolymphozytentoxizitätstest:
7.1 Eine Lymphozytensuspension mit mindestens 80 % Vitalität und ohne übermäßige Kontaminierung durch nicht-
lymphozytische Zellen vorbereiten
7.2 Die Invitrogen™ HLA-Typisierungsplatten aus dem Gefrierschrank nehmen, auftauen und bei sofortiger Verwendung
auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Die restlichen gefrorenen Platten wieder bei -55°C oder kälter im Gefrierschrank
ohne Abtauautomatik aufbewahren.
7.2.1 Platten aus geöffneten Packungen sollten sofort verwendet oder maximal einen Monat bei -55°C oder kälter aufbewahrt
werden.
7.3 Mit einer 50 µl Spritze 1 µl der Lymphozytensuspension (ca. 3.000 Lymphozyten) auf jedes Well geben. Sorgfältig
darauf achten, dass keine Berührung mit den Antiseren stattfindet. Jedes Well prüfen, um sicherzustellen, dass
Lymphozytensuspension und Antiserum gut vermischt sind.
7.4 Die Platten bei Raumtemperatur (22°C ±3°C) inkubieren.
Klasse I (Farbstoffausschluss) 30 min
Klasse I (Fluoreszenz) 30 min
Klasse II (Fluoreszenz) 45 min
7.5 Mit einer 250 µl Spritze 5 µl des im Plattenpaket enthaltenen Kaninchen-Complements auf die Wells geben und
sorgfältig darauf achten, dass die Antiserum/Lymphozyten-Mischung nicht mit der Spritzenspitze in Berührung kommt.
Hinweis: Invitrogen™ HLA-Typisierungsplatten sind mit der vielen Ergänzung optimiert worden, die mit dem Satz
versorgt worden ist. Bei Verwendung eines anderen Complements besteht die Gefahr von schwachen Reaktionen
oder falsch positiven Ergebnissen.
7.6 Die Platten bei Raumtemperatur (22°C ±3°C) inkubieren.
Klasse I (Farbstoffausschluss) 60 min
Klasse I (Fluoreszenz) 50 min
Klasse II (Fluoreszenz) 60 min
7.7 Unter Verwendung einer 100 µl oder gleichwertigen Spritze 2 µl gefilterte wässrige Eosin Y-Lösung mit einer
Konzentration von 5 % in jedes Well geben und bei Raumtemperatur (22°C ± 3°C) 3-5 Minuten inkubieren. Darauf
achten, dass die Antiserum/Lymphozytenmischung nicht mit den Spritzenspitzen in Berührung kommt. Bei Verwendung
eines auf Fluoreszein basierenden Tests ist dieser Schritt nicht notwendig.
7.8 Mit einer 250 µl Spritze 5 µl gefiltertes neutral gepuffertes Formalin in jedes Well geben und darauf achten, dass keine
Berührung mit der Antiserum/Lymphozytenmischung stattfindet. Diesen Schritt überspringen, wenn auf Fluoreszein
basierende Tests verwendet werden.
7.8.1 Auf Fluoreszein basierende Tests: 5 µl Propidiumiodid in Quench-Lösung in jedes Well geben und darauf achten, dass
keine Berührung mit der Antiserum/Lymphozytenmischung stattfindet.
7.9 Ein Deckglas auf der Platte anbringen und die Platten 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, damit sich die
Lymphozyten absetzen können.
7.9.1 Mit Eosin Y gefärbte Platten können nach einer Stunde oder am nächsten Tag abgelesen werden.
7.9.2 Mit Fluoreszein gefärbte Platten können nach 30 Minuten oder am nächsten Tag abgelesen werden.
Hinweis: Wird die mit Fluoreszein gefärbte Platte erst nach 36 Stunden abgelesen, besteht eine erhöhte Gefahr
falsch positiver Ergebnisse.
7.10 Den Test mit einem Phasenkontrastmikroskop unter 150-facher Vergrößerung ablesen.
8 Ergebnisse:
8.1 Tote Zellen (die das Antigen enthalten) absorbieren den Farbstoff, sehen größer und dunkler aus und weisen einen
deutlichen Kern auf. Vitale Zellen (ohne das Antigen) schließen den Farbstoff aus und sehen im Vergleich zu den toten
Zellen heller und kleiner aus.
8.2 Die fluoreszierend markierten vitalen Zellen sind grün und die nicht-vitalen Zellen sind rot.
8.3 Nach Korrektur für Prozent toter Zellen in negativen Kontroll-Wells wird der Test wie folgt ausgewertet:
% tote Zellen Score Interpretation
0-10 1 Negativ
11-20 2 Zweifelhaft
Negativ
21-50 4 Schwach Positiv
51-80 6 Positiv
81-100 8 Stark Positiv
-- 0 Unleserlich
9 Leistungsstandards:
9.1 Spezifizität und Sensitivität
9.1.1 Die Invitrogen™ HLA-Typisierungsplatten wurden im Rahmen von umfangreichen internen und externen
Screeningverfahren gegen ein gut qualifiziertes, aus mehreren ethnischen Gruppen bestehendes Lymphozytenprofil
geprüft. Verdünnungen und Spezifizität jedes Invitrogen™ HLA-Typisierungsserums im Plattenpaket wurden durch
Titration (unter Verwendung sequenzieller Verdünnungen) gegen Lymphozytensuspensionen mit bekannten HLA-
Typen bestimmt. Jedes Serum wird mit seiner optimalen Verdünnung eingesetzt, um den maximalen Reaktionswert zu
erzielen und gleichzeitig die Spezifizität zu bewahren. Die meisten Seren liefern R-Werte von 0,8 und besser. Die
jedem Plattenlot beiliegenden Analysezertifikate bieten hilfreiche und aufklärende Informationen bei unerwarteten
Reaktionen.
9.1.2 Invitrogen™ HLA positives Kontrollserum (Antihuman-Lymphozytenserum vom Kaninchen) ist auf jeder Platte
enthalten.
9.1.3 Invitrogen™ gepooltes Humanserum (PHS) wird als negatives Kontrollserum auf jeder Platte eingesetzt. Die Resultate
eines Screening-Tests dieses Serums nach standardmäßigen mikrolymphozytentoxischen Testverfahren waren negativ
für lymphozytentoxische Antikörper gegen T-Zellen und B-Zellen.
10 Fehlersuche:
10.1 Ursachen für starke Hintergrundfärbung oder falsch positive Ergebnisse:
10.1.1 Die Probe weist eine niedrige Zellvitalität oder beschädigte Zellen auf. Die toten Zellen vor Übertragung auf die
Typisierungsplatte entfernen oder eine neue Zellsuspension herstellen.
10.1.2 Die Probe ist mit Granulozyten oder anderen Nicht-Lymphozyten kontaminiert. Die nicht lymphozytischen Zellen vor
Übertragung auf die Typisierungsplatte entfernen oder eine neue Zellsuspension herstellen.
10.1.3 Reagenzien, die toxische Substanzen enthalten oder einen pH-Wert außerhalb des physiologischen Bereichs aufweisen,
können eine Beschädigung der Zellen verursachen. Sicherstellen, ob die verwendeten Reagenzien ordnungsgemäß
geprüft wurden.
10.1.4 Complement ist zu stark oder hat eine zu hohe Toxizitätskonzentration. Benutzen Sie den Bauplatz, den spezifische
Ergänzung mit dem Satz versorgt hat.
10.1.5 Inkubationszeit ist zu lang. Darauf achten, dass diese Gebrauchsanweisung und die vorgegebene Inkubationszeit je
nach verwendeter Zellisolationsmethode genau befolgt wurde.
10.1.6 Unvollständige Reaktion oder falsch positive Ergebnisse können durch Zellen- oder Serumübertragungen verursacht
werden.
10.2 Ursachen für schwache Reaktion oder falsch negative Ergebnisse:
10.2.1 Die Probe ist zu konzentriert. Sicherstellen, dass die Zellenkonzentration auf 2-3 x 106 Zellen/ml justiert wurde.
10.2.2 Die Probe ist mit Thrombozyten kontaminiert.
10.2.3 Der pH-Wert der Reagenzien hat sich auf Grund einer Aussetzung an CO2 oder durch bakterielle Kontaminierung
verändert. Frische Reagenzien verwenden und vor der Verwendung den pH-Wert prüfen.
10.2.4 Complement ist zu schwach oder wird vor Übertragen auf die Platte inaktiv. Benutzen Sie den Bauplatz, den
spezifische Ergänzung mit dem Satz versorgt hat.
10.2.5 Falsche Inkubationstemperatur. Niedrige Temperaturen verursachen eine langsamere Reaktion, wogegen hohe
Temperaturen zu einer Zersetzung der thermolabilen Bestandteile führen. Darauf achten, dass die
Inkubationstemperatur von 22°C ± 3°C eingehalten wird.
10.2.6 Die Inkubationszeit ist zu kurz. Darauf achten, dass diese Gebrauchsanweisung und die vorgegebene Inkubationszeit je
nach verwendeter Zellisolationsmethode genau befolgt wurde.
11 Grenzen und Vorsichtsmaßnahmen:
11.1 Das Kaninchen-Complement ist ein wichtiges Reagenz im lymphozytentoxischen Testverfahren und kann von Lot zu Lot
leichte Unterschiede aufweisen. Ein mangelhaftes Complement führt zu schwachen oder falschen Reaktionen bzw. zu
einem starken Hintergrund in der Negativkontrolle. Die Aktivität des Kaninchen-Complements kann durch eine Prüfung
mit entsprechenden Positiv- und Negativkontrollen sowie mit bekannten Lymphozyten und Antiseren nachgewiesen
werden.
11.2 Invitrogen Corporation empfiehlt dass der Gebrauch die spezifische Ergänzung vom Bauplatz, der mit Satz versorgt wird.
11.3 Invitrogen™ HLA-ABC und DR Complement wurden individuellen Qualitätskontrollen unterzogen, um minimale Titer-
und Hintergrundtoxizität zu gewährleisten (siehe Katalog und/oder Packungsbeilage des Complements). Es ist jedoch
ratsam, aus jedem neuen Complement-Lot Proben zu entnehmen und parallel mit einem vorhandenen oder bekannten Lot
zu testen. Ein geeignetes Kaninchen-Complement sollte eine Stärke von 8 mit der Positivkontrolle und der Mehrheit der
positiven Reaktionen aufweisen. Mit der Negativkontrolle und der Mehrheit aller negativen Wells sollte es eine
Stärkeablesung von 1 aufweisen.
11.4 Aussetzung an CO2 sollte vermieden werden, da dies pH-Wertveränderungen verursachen kann, die sich nachteilig auf
das Complement auswirken.
11.5 Eine im HLA-System mögliche Kreuzreaktivität kann falsch positive Reaktionen zur Folge haben. Einige der im HLA-
Typisierungsplattenpaket enthaltenen Antiseren weisen eine breite (supertypische) Spezifizität auf. Diese Antiseren sind
auf dem Arbeitsblatt angegeben.
11.6 HLA-Testverfahren unter Verwendung der Invitrogen™ HLA-Typisierungsplatten müssen unter Aufsicht eines
qualifizierten Leiters, technischen Vorgesetzten oder allgemeinen Vorgesetzten nach anerkannten Laborstandards
durchgeführt werden. Wir heben ausdrücklich hervor, dass diese Produkte nur für den professionellen Gebrauch
bestimmt sind.
11.7 Proben sollten bis zur Verwendung bei Raumtemperatur gelagert werden, und bei der Probengewinnung sollte kein
EDTA als Antikoagulationsmittel eingesetzt werden.
11.8 Alle Typisierungsergebnisse sollten mit einer anderen Typisierungsmethode bestätigt werden.
PR006
Revision 05
Druck 8/08
European Representative:
Invitrogen Ltd..
11 Bassendale Road
Croft Business Park
Bromborough, Wirral
CH62 3QL, U.K.
Tel: 44 151 346 1234
Invitrogen Corporation
9099 North Deerbrook Trail
Brown Deer, Wisconsin 53223 USA
Tel: (800) 955-6288
Fax: (800) 331-2286
www.invitrogen.com
Selbst-Zertifierte Produkte (CE markiert)
149986 HLA C Locus Typisierungsplatten
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